Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 133
Текст из файла (страница 133)
х с % $ о х с а х Ф Ф Ф = О. Ф а О н а — 8 гЧ л д ч Ю Г о о т Ф чо х ф о4 о т о в Ч в о х ~ с о. Ф о х 3 в д а с' о о а ца Ю о О. х о х 2 л с о -с с О ОЗ т т а л Е а Ф о а о о О н н Ф н~п н До с со% н а й ннлО н <ц х Ю а вн о е~ е Рис. 7.32. Иммунопреципитация кроматина. Этот метод позволяет определить в геноме все участки, занимаемые регулвторным белком ш угуо.
Амплификация ДНК методом цепной полимеразной реакции (ПЦР] представлена на рис. 8 45. Определить осажденные амплифи- цированныефрагментыдНКможнопутемгибридизациисмеснфрагментовсДНК-микрочипами, как описано в главе 8. регуляторный белок А ген 1 регуляторный белок В 'аа ген 2 ПОПЕРЕЧНАЯ СШИВКА БЕЛКОВ С ДНК ПРИ ПОМОЩИ ФОРМАЛЬДЕГИДА РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК НА МАЛЫЕ (-300 НУКЛЕОТИДОВ) ФРАГМЕНТЫ ПРЕЦИПИТАЦИЯ ДНК ПРИ ПОМОЩИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ РЕГУЛЯТОРНОГО БЕЛКА А ЗВИЛЮЧВНИВ Белки, регулирующие транс крипцию генов, распознают карат кие отрезки двойной спирили ДНК имеющие специфическую последова тельносгпгь и при этом определяют, какой из тысячи генов в клетке бу. депг тринскрибирован.
Для широкого круга организмов определены тыся чи регуляторных белков. Казкдьгй из этих белков обладает своими уни кальными чертами, но большинство связываются с ДНК в виде гомодимеров или гетеродимеров и распознают ДНК с помощью одного из небольшого чгзсла структурных мотивов. Обычно встречаются мотивы спираль поворот спираль, гохгеодомен, «лейциновая мол ния», спираль петля спираль и нескольких видов «цинковых пальцев».
Точная аминокислотная последовательяоспгь, сотпавляющая мотив, определяет раг познивиемую регуляторным белком специфическую последовательность ДНК. а Эгот метод нсоывается СИР смр. — Призг.регк " Развитие в последние годы высокопроизводительного секвентювання следующего поколения . пехг яепегабоп зп)пепсшк —. позволяет проводгпь прямое секвеннрование фрагментов ДНК, связавшихся с нссаедуемым белком Этот мешд называется СШР мЧ.
Прил.ред. дого «осажденного» фрагмента ДИК в составе генома." Таким образом все участки, занятые регуляторным белком в исходных клетках, могут быть от мечены на генетической карте генома клетки (рис. 7.33).а Иммуиоцреципитацию хроматина также часто применяют для локали зации в геиоме тех участков, укладка которых производилась различными типами модифицированных гистоиов (описано в главе 4).
В данном случае применяются антитела, сиецифичньге к определенной, интересующей моди фикации гистоиов. ф,ф'Ж а„ РАЗРУШЕНИЕ ФОРМАЛЬДЕГИДНЫХ СШИВОК, УДАЛЕНИЕ БЕЛКА АМПЛИФИКАЦИЯ ОСА)КДЕННОИ ДНК ПРИ ПОМОЩИ ПЦР ДНК, СООТВЕТСТВУЮЩАЯ ТЕМ УЧАСТКАМ В ГЕНОМЕ, КОТОРЫЕ В КЛЕТКАХ БЫЛИ ЗАНЯТЫ РЕГУЛЯТОРНЫМ БЕЛКОМ А рые эти белки распознают. Сейчас мы рассмотрим, как работают эти компоненты, включая и выключая гены в ответ на разнообразные сигналы. В середине ХХ века идея о том, что гены можно включать и выключать, была революционной. Это представление стало главным прорывом в нашем понимании механизмов регуляции генов, а первоначально возникло при изучении адаптации бактерий Е.
сой к изменениям состава питательной среды. Параллельные исследо вания бактериофага лямбда привели ко множеству аналогичных выводов н помогли установить лежащий в основе этого механизм. Многие из этих же принципов при менимы и к эукариогическим клеткам. Однако невероятная сложность регуляции генов у высших организмов, наряду с упаковкой их ДНК в хроматин создает определенные проблемы и предоставляет некоторые совершенно новые возможности для регуляции, как мы увидим далее. Начнем с простейшего примера: включение и выключение генов у бактерий в ответ па единственный сигнал.
7,3,1. Триптофвновый репрессор является простым генетическим переключетелем, Вилючеющим и Выключзющим гены бвктерий Хромосома бактерии Е. со1т — одноклеточного организма, состоит из един ственной кольцевой молекулы Д11К, насчитывающей 4,б х 1Оь нуклеотидных пар. Эта Д11К кодирует примерно 4300 белков, однако в конкретный момент времени в клетке синтезируется лишь часть этих белков. Экспрессия многих гегюв рогу,ти руется в соответствии с доступностью питательных веществ в среде, что показано на примере пяти генов Е. со(г', коднрующих ферменты, необходимые для синтеза аминокислоты триптофана.
Эти гены организованы в один оперон (орегон), то сеть расположены рядом друг с другом и транскрибируются с одного промотора (рготоГег) как одна ллинная молекула РНК (рис. 7.34). Однако если в питательной среде присутствует триптофан и он поступает в клетку (например, если бактерия находится в кишечнике млекопитающсго, которое только что съело белковую пищу), то клетке больше не требуются эти ферменты — и их синтез выключается.
Молекулярные механизмы, лежащие в основе такого переключения, достаточно хорошо изучены. Как описано в главе 6, промотор является специфической последо вательностью ДНК, которая направляет действия РНК-полимеразы на связывание с ДНК, разворачивание двойной спирали и начало синтеза молекулы РНК. Про мотор, который направляет транскршщию генов биосинтеза триптофана, содержит регуляторный элемент. называемый оператором (орега(ог; см. рис. 7.34).
Он пред промотор Е о с в А кромосома Е.соя молекула мРНК а а ферменты биосинтеэа триптофана Рис. 7.34. Кластер генов Е. сов, который козргруег ферментьг для синтеза аминокисвоты триптофана. Эти пать ~енов триптофанового оперона (Тгр-оперон), обозначенные как Горл, В, С 0 и Е, транскрибируютсл как одна молекула мРНК, что позволвет контролировать их экспрессию совместно. Кластеры генов, транскрибируемых как одна молекула мРНК, типичны длл бактерий.
Каждый такой кластер называетсв опероном. ГЕНЫ ЙЫКПК>ЧЕНЫ Гены екп(с>цены Рис.7.36. Соединение триптофана с белком-репрессором тригпофанового оперона изменяет конформацию репрессора. Конформацио нное изменение дает возможность этому ре гул кто рному белку тесно связываться со специфической последовательностью ДНК (оператором) и, таким образом, блокировать транскрипцию генов, которые кодируют белки,необходимыедля синтезатриптофана(тгр-оперон). Трехмерная структура этого бактериальн ого белка, содержащего мотив спираль-поворот спираль, определена с помощью метода дифракции рентгеновских лучей н показана как в случае связывания триптофана, так и без него. Связывание триптофана приводит к увеличению расстояния между двумя узнающими спиралями в гомодимере, что позволяет репрессору плотно садиться на оператор.
(Адаптировано из В. 2ьапб ет аг., Ягогиге 327: 591 — 597, 1987. С разрешения Масп>г(гап РоЫВЬегз (.М.] 7.3.2. Акти((звтос>ы трпнснрмггцргрг пипгочпгот гены В главе 6 описано, что очищенная РНК полимераза Е. сой (включая ее о-суб>ъединицу) может связываться с промотором и инициировать транскрип цию ДНК. Однако многие бактериальные промоторы только в незначительной степени функциональны сами по себе, поскольку либо они плохо распознак>тся РНК полимеразой, лиГю полпмеразе сложно развернуть спираль ДНК и начать транскрипцию.
В любом случае этим гигохо функционирующим промоторам мо гут помочь регуляторныс белки, которые связываются с соседним участком ДНК и контактируют с РНК-полнмеразой таким образом, что значительно увеличивают вероятность инициации транскрипции. Поскольку активная, связывающаяся с ДНК форма таких белков включает гены, этот метод регуляции генов называется позитивной регуляцией (ров)6уе соп(го1), и регуляторные белки, которые действуют подобным образом, известны как активаторы пгранскрипйии ((гапхспр((опа! асгп>а(огх), илн белки активаторы генов (депе асгп>агог ргогеггц).
В некоторых случаях бактериальные белки активаторы помогают РНК полимеразе связаться с промогором путем предоставления дополнительной поверхности для контакта. В других случаях они контактируют с РНК полимеразой и способствуют ее пере ходу из первоначальной ДНК-связывающей конг(к>рмации в активную транскри бирующую форму посредством стабилизации переходного состояния фермента. Как и репрессоры, белки активаторы генов должны быть связаны с ДНК, чтобы реализовывать присущую им активность. Таким образом, каждый регуляторный белок действует избирательно, контролируя только те гены, которые содержат распознаваемую им последовательность ДНК.
Связанные с ДН К белки активаторы могут увеличивать интенсивность инициации транскрипции в! 000 раз -- величина, отвечающая относительно слабым и нсспецифиче скими взаимодействиям между активатором и РНК ггслимеразой. Например, изменение репрессор фага пямбда РНК-попимервзе / Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
