Биохимия 2 (1984) (1128710), страница 21
Текст из файла (страница 21)
14.8. 14. Окислительиое фосфорилироваиие 79 Синтез АТР осуществляется молекулярными ансамблями во внутренней митохондриальной мембране. Соответствующий ферментный комплекс (разд. 14.8) назван митохондриальной АТРазой, потому что он был открыт благодаря способности катализировать гидролитические реакции. Каким образом осузцествляется сопряжение между окислением ХАРИ и фосфорилированием А(эР? Вначале предполагалось, что при переносе электронов происходит образование ковалентного высокоэнергетического промежуточного продукта, являющегося предшественником АТР. Эта гипотеза химического сопряжения основывалась на механизме субстратного фосфорилирования, примером которого служила глицеразьдегид-3-фосфат — дегидрогеназная реакция, приводящая к образованию 1,3-БФà — высокоэнергетического промежуточного продукта (разд.
12.14). Высказывалось и другое предположение, а именно что свободная энергия окисления улавливается белком, находящимся в активированной конформации, что затем стимулирует синтез АТР. Исследователи во многих лабораториях в течение десятилетий пробовали выделить эти предполагаемые высокоэнергетические промежуточные продукты, но все предпринятые попытки оказались безуспешными.
Совершенно иной механизм, хгмиосмотическую гипотезу, постулировал Питер Митчелл (Ре1ег Мйсйей) в 1961 г. Он предположил, что сопряжение переноса электронов и синтеза АТР обеспечивается протонным Прн переносе электронов по дыхательной цепи происходит генерирование протонного градиента и мембранного потенциала на внутренней митохондриальной мембране. градиентом, а не вгясокоэнер~ етическим ковалентным промежуточным продуктом или активированным белком. Согласно этой модели, перенос электронов по дыхательной цепи приводит к выбросу протонов из матрикса на цитоплазматическую сторону внутренней митохондриальной мембраны, где таким образом возрастает концентрация ионов Н . В результате происходит генерирование мембранного потенциала с положительным зарядом на цитоплазматической стороне мембраны (рис. 14.8). Эта протонодвнжущая сила, постулирует автор, запускает синтез АТР АТРазным комплексом.
В описанной модели взаимодействие между цепью переноса электронов и АТР- синтезирующим комплексом осуществляется лишь благодаря наличию мембранного потенциата. Модель требует, чтобы переносчики электронов в дыхательной цепи и АТРаза имели векторную организацию, т.е. чтобы они были определеннным образом ориентированы по отношению к двум поверхностям внутренней митохондриальной мембраны. Далее, внутренняя митохондриальная мембрана должна бьггь совершенно непроницаема для протонов, поскольку для существования протонного градиента необходимо наличие замкнутого компартмента.
Основной смысл предложенного механизма состоит в том, что первичным эапасаютцим энергию антон.явллепн сч перенос протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану. Гипотеза Митчелла о сопряжении окисления и фосфорилирования протонным гра- Нврутянвя мнтояондрнвяьнвя мембране Внутренняя ннтояонаанвяьнвя ненбявнв Метямембрвнное проотрвнотво диентом получила к настоящему времени множество подтверждений. 1. Протонный градиент через внутреннюю митохондриальную мембрану создается во время переноса электронов. рН с наружной стороны на 1,4 единицы ниже, чем с внутренней, и мембранный потенциал составляет 0,14 В, причем наружная сторона несет положительный заряд. Общий электрохимический потенциал Лр (в вольтах) складывается из мембранного .потенциала (Лф) и градиента концентрации ионов Н" (йрН).
В приведенном ниже уравнении )1 — газовая постоянная, Т - абсолютная температура, Г-число Фарадея. с)р = АФ вЂ” ЛрН = Лф — 0,06брН = йТ Г = 0,14 — 0,06 ( — 1,4) = 0,224 В. МАОН МАОН.О- родуктякв Бкоккрувток ротекоиом и амитяяом ан Цитокром Ь Брокирувтск — внтимицином А Т Цктокром ос Цктокром о 1 Цитохромы в и в3 Бвокируетоя — СМ-, МН3- и СО Ог Рис. 14.9.
Пункты действия некоторых ингнбнторов транспорта электронов. Часть Н. Генерирование и хранение энергии 80 Эта общая протонодвижушая сила в 0.224 В соответствует свободной энергии 5,2 ккал в расчете на 1 моль протонов. 2. При создании градиента рН в митохондриях или хлоропластах (разд. 19.13) в них происходит синтез АТР в отсусссвие переноса электронов. 3.
Белок пурпурных мембран галобактерий прн освещении перекачивает протоны (разл, 19.21). Синтетические пузырьки, содержащие этот бактернальный белок и очищенную АТРазу из митохондрий сердца крупно~о рога~ого скота, синтезируют АТР при освещении. В этом опыте белок пурпурных мембран заменяет дыхательную цепь; слеловательно, дыхательная цепь и АТРаза-биохимически отлельные сиссемы, связываемые только протонным градиснтом. 4. И дыхательная цепь (разд. 14.7), и АТРаза (разд. 14.8) имеют векторную организацию во внутренней митохонлриальной мембране.
.5. Для окислительного фосфорилирования существенное значение имеет замкну- гость компартментов. В растворимых препаратах или в мембранных фрагментах, лишенных хорошо отграниченных внутренних и внешних компартментов, не происхолит синтеза АТР, сопряженного с переносом электронов. 6. Вещества, переносящие протоны через внутреннюю митохондриальную мембрану. разрушают протонный градиент и таким образом вызывают разобщение окисления и фосфорилирования (разд.
14.14), 14.6. Протонный градиепг генерируется в трех пунктах Выброс протонов происходит в трех пунктах потока электронов по дыхательной цепи от ХА13Н к Ох (рис. 14.9): 1-й луикел — это )ь(А)3Н-Π— релуктазный комплекс; 2-й лук клс — ЯН 3-цитохром-с — редуктазный комплекс; 3-й л)нкга — цитохром-с — оксидазный комплекс. Про~онный градиент, генерируемый в каждом из пунктов при переносе пары электронов от )к)А)3Н, используется для синтеза одной молекулы АТР. Для идентификации этих пунктов применялись различные экспериментальные подходы.
1. Сравнение выхода АТР при окислении нескольких субсисраснав. Окисление ХА)3Н дает три АТР, тогда как окисление сукцината дает два АТР. Электроны от ЕА)3Н3 поступают в цепь переноса электронов на уровне кофермента О, который находится на более низком энергетическом уровне, чем 1-й пункт фосфорилирования. При окислении нефизнологического субстрата аскорбата образуется только одна молекула АТР, потому что электроны аскорбата поступают на цнтохром с, находящийся на более низком энергетическом уровне, чем 2-й пункт фосфорилнрования.
Окислительное фосфорилированне часто характеризуют отношением Р;Π— число молей неорганического фосфата, включающегося в органическую форму, в расчете на один атом потребляемого кислорода. Отношения Р: О для окисления ЫАРН, сукцината н аскорбата составляют соответственно 3, 2 и 1. 2. Термадинимическив измерения. Значение Лбы для переноса электронов от ХАРН на находящийся на более низком энергетическом уровне Ре-Б-центр в )ь)АРН-Π— редуктазе составляет — 12 ккалумольп для переноса электронов от цитохрома Ь к с, в ЯНз-цитохром-г — редукгазе .
1О ккал/моль и от цитохрома а к Оз в цнтохром-г — оксидазе — 24 ккал7моль. Эти окислигельно-восстановительные реакции являются в достаточной степени экзергоническими для запуска синтеза АТР при стандартных условиях (Лбь' = — 7,3 ккал7моль). Значения сзбь' для других реакций переноса электронов, опосредуемых кофермснтом 11 и цитохромом с, слишком малы для поддержания синтеза АТР.
3. Специфическое иигибирование таки элвюиринав. Ротенон и амнтал специфически ингнбируют перенос электронов в ХАРИ-Я вЂ” редуктазном комплексе и таким образом предотвращают генерирование протонного гралиента в 1-м пункте (см. рнс, 14.9). В то же время указанные ингибиторы не нарушают окисления сукцината, поскольку электроны этого субстрата поступают в цепь переноса электронов после блока кофермента О. Аитимичии А тормозит ток электронов между цитохромами Ь и с,, предотвращая синтез АТР, сопряженный с генерированием протонного срадиента во 2-м пункте.
Этот блок можно обойти добавлением аскорбата, который непосредственно восстанавливает цнтохром с. Электроны затем пойдут ог цнтохрома с к О, с одновременным синтезом АТР, сопряженным с протонным градиентом в 3-м пункте. Наконец, ток электронов может быть блокирован между цитохромоксидазным комплексом и О, пол лействием СХ, Х, и СО, ь 33 Цианид и азин реагируют с ферриформой этого переносчика, тогда как оксид углерода ингибирует ферроформу. В присутствии этих ингибнторов из-за блокирования тока электронов не происходит фосфорилирования, сопряженного с генерированием протонного градиента в 3-м пункте.
Места действия этих ннгибиторов были установлены с использованием менюди иере- креста. Бриттон Чанс (Впцоп Сйапсе) предложил изящный спектроскопический метод для определения соотношения окисленной и восстановленной форм каждого переносчика. В основе метода лежит тот факт, что окисленная и восстановленная формы каждого переносчика имеют свои характерные спектры поглощения. Добавление ннгибнтора переноса электронов изменяет соотношение этих форм. Например, добавление антимицина А вызывает переход переносчиков, локализованных в электронтранспортной цепи между МАРН и цитохромом Ь, в более восстановленное состояние, а переносчиков между цитохромом с и О, — в более окисленное состояние. Отсюда можно заключить, что антимицин А подавляет превращение цитохрома Ь в цитохром с,, потому что этот этап является пунктам перекрести.
4. Синтез системы иузырькав, садержаигих лишь один пункт выброса протопит Каждый из трех участков выброса прогонов был воспроизведен в синтетических фосфолипидных пузырьках, содержащих АТРазу. Добавление к таким пузырькам окисляемого субстрата приводит к генерированию протонодвижущей силы, достаточной лля синт.еза одной молекулы АТР на пару электронов. 14,7, Протоны выгалквваются асимметрично приентированнымн траисмембранными комплексами Генерирование протонного градиента при потоке электронов через три участка дыхательной цепи, в которых происходит запасанис энергии, требует их асимметричной ориентации. Кроме того, три соответствующих ферментных комплекса должны располагаться на мембране таким образом, чтобы протоны могли перекачиваться со стороны матрикса на цнгоплазматическую сторону. Изучению этих важных аспектов 14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
