Биохимия 1 (1984) (1128709), страница 7
Текст из файла (страница 7)
' Термин «протеин» введен Мулдером (1лебеп Г. ОсчсЬ(сЬГе бег РЬуь)о(овгасьеп СЬепне, 1.егрбя опд %?еп, 1. )3еосйсе, !935, 5. 359)5-Прим. ред. Ту .Сао Ч»Г Суа-6Гу.СГ».Агсл6Гу-Раа Рьа-Туг ТогРгацу«АГа ?о ?5 зо гидных цепей формируются высокоспецифичные трехмерные формы. При этом последовательность аминокислот в белке служит связующим звеном между генетической информацией, заложенной в ДНК, и трехмерной структурой белка, лежащей в основе его биологической активности. В-тресьих, изменения в последовательности аминокислот могут привести к нарушению нормальной функпии белка, а следовательно, и к соответствующей болезни. В частносги, такая тяжелая болезнь, как серповидно- клеточная анемия, нередко приводящая к легальному исходу, возникает в результате замены всего лишь олной-единственной аминокислоты в одном-единственном бслке.
Таким образом, определение последовательносги аминокислог относится к новой области медипины — молекулярной пазологии, В-четвертых„данные о последовательности аминокислот в белке могут многое рассказа~ь о его эволюции. Дело в том, что в неродственных белках эти последовательности совершенно различны. Белки лишь в том случае имеют сходную последовательность аминокислот, если они происходят от общего белка-предшественника. Следовательно, изучение последовательностей аминокислот в белках позволяет ггрослелить эволюцию на молекулярном уровне.
(Для обозначения аминокислот использованы общепринятые сокращения, приведенные в табл. 2.1, стр. 23.) Прежде всего необходимо определить иминокисиигппый с оспгие лап?види. Для этого его гидролизуют до составляющих аминокислот нагреванием до 110ьС в течение 24 ч в 6 и. НС1. Далее аминокислоты полученного гилролизага разделяют методом ионообменной хро- 2. Основные представления о структуре и функции белков 27 О Ниигидрии Оихвявеквиии виюции Рис.
2.26. матографии на колонке с сульфонированным полистиролом. Фракционированные аминокислоты определяют по окраске, образующейся при нагревании с нннгндрнном: а-аминокислоты лают с нингидрииом интенсивное синее окрашивание, а иминокислоты, например пролин,— желтое. Метод ионообменной хроматографии обладает высокой чувствительностью: Оеъви Аминокислоты, содержащиеся в гидролизате белка, разделяют методом ионообменной хроматографии на сульфонированном полистироле (например, дауэкс-50). Для злюции аминокислот с колонки используют буферы с возрастаюшим значением рН. Первым снимается с колонки аспартат, имеюший кислотную боковую цепь; аргинин с основной боковой цепью элюируется последним.
По оси ординат отложено поглощение. Часть 1 Конформации и динамика с его помощью можно определить даже один микрограмм аминокислоты, т.е, примерно столько, сколько содержится в одном отпечатке пальца. Количество аминокислоты пропорционально оптической плотности раствора после нагревания с нингидрином. Если требуется определить еше меньшие количества аминокислоты— порядка нескольких нанограммов, то используют флуорескамин, который реагирует с а-аминогруппой, образуя сильно флуоресцирующее соединение.
О природе аминокислоты судят по объему элюции, т, е. по объему буфера, использованному для вымывания данной аминокислоты с колонхи (рис. 2.2б). Сравнение результатов хроматографии гндролизата со стандартной смесью аминокислот свидетельствует о том, что исследуемый пептнд имеет следуюший аминокислотный состав: (А)а, Агй, Авр, Ыу, Р)зе). Скобки показывают,что речь идет о составе, а не последовательности аминокислот в пептиде.
>а.оо-сн га >О ООО Оо Н О о !! Н Н вЂ” С вЂ” С вЂ” 6!у — Азр — Ртге — Агй — 6!у — С 2 СН. О !ч )чо Мечеиие Н Н О ! лг От!ч Н вЂ” С вЂ” С вЂ” 6гу — Азр — Рве — Агй — 6!у — С / О СН, !ЧО Гидропиз Н Н О ! 02 / Н вЂ” С вЂ” С вЂ” О !чо 6!у Азр 6!у Рне Агн Рве. 2.27.
Н3С,гСНг ы !чО гЧОт Е оторднннтреаентеп 80 С! 2. Основные представления Дпненпппернд о структуре и фугипвщ белков 29 Определение Х-концевого остатка пептида. Пептид метят фтординитробензолом (реактив Сэнгера) и затем гидролизуют. ДНФ-производное аминокислоты (в приведенном примере ДНФ-алании) идентифицируют по хроматографическим характеристикам. Для определения в белке или пептиде концевого остатка, несущего аминогруппу, его метят с помощью соединения, образующего стабильную ковалентную связь с азатом аминогруппы (рис. 2.27). Впервые для этой цели Сэнгер использовал фпгординипграбензол (ФДНБ), реагирующий с незаряженной з-)ч)Н,-группой с образованием динитрофенильного !ДНФ) производного пептнда желтого цвета Связь между ДНФ и концевой аминогруппай стабильна в условиях, используемых лля гидролиза пептидных связей. Поэтому при гидролизе ДНФ-производного пептида А!а-О!у-Азр-РЬе-Агй-О)у в б н.
НС! высвобождается ДНФ-аминокислота, которую можно щгентифицировать хроматографически как ДНФ-алании. Для идентификации г)-концевых аминокислот в настоящее время часто используют донсилхлорид, который при взаимодействии с аминогрупцои дает стабильное, интенсивно флуоресцирующее сульфамидное производное. Этот метод позволяет выявить )х)-концевую аминокислоту (после кислотного гидролиза пептидных связей), присутствующую в ~аком незначительном количестве, как несколько нано> раммов. При всех дос>оинствах методов определения >ч-концевь>х вминокислотных остатков с помощью ДНФ или лацсилхлорида их, к сожалению, нельзя использовать дважды применительно к одному и тому жс пептиду, поскольку послелний полностью распадается при кислотном >идролнзе.
Перу Эдману (Р. Ед>пап) удалось разработать метод маркирования (н(-концевого остатка и отшеплеиия его от пептида без сопутс>вующе>о расщепления остальных пептидных связей, Дв'ридиция ио )джин)' (рвикцин Эд>щии) состои> в ступенчатом (по одному) огщснлснии вминокнслотных остатков с аминоконца псптида (рис. 2.2>)). Фвиилиютиоциаиил> реагирует с незаряженной концевой Овнивитотиоционвт аминогруппой пепгииа с образованием фснилтиокарбамоильного производного. Далее в слабокислой среде происхолнт отщеплецне циклического произволного )н(-капиевой аминокислоты, в оставшийся неразрушенным нептил оказывается укороченным на олин аминокислотный остаток.
Указанное циклическое производное представляет собой фенилтиогидантоин-ами>юкислоту (ФТГ-аминокислоту). Его идентифицирую> методом хрома>аграфии, Далее аминокислотный состав укороченного пептида (Агрн Азр, С1у>, Р)>е) сравнивают с исходным: (А1а, Агй, Азр, С!у„Р)>е). Оказь>вастся, ч>о различие состоит в одном остатке аланнна. Следовательно, в исходном пе>пиде алании занимает Х-концевое наложение. Деградацию по Эдману можно вновь повторить на укороченном пептиде. Исходя из амннокислотного состава после второй ступени дегралации (Агя, Азр, С!у, Р)>с) можно прийти к выводу, что вторым остат- Часть ! Конформация н динамика ком с )Н)-конца является глицин.
Это заключение подтверждают путем хроматографической идентификации ФТГ-глицнна. полученного на второй ступени де> радации псптида. Еще три ступени деградации по Элману позволяют полностью раскрь>ть последовательность аминокислот во взятом псптиде. Стратегию анализа последовательности аминокислот в белках можно определить как «разлеляй и властвуй».
Белок подвергают гигцифи >в«киму риги>гилвнию пи болев корол>кис лели>и>)ы, поспелова> ельнос > ь аминокислот в которых определяют по Эдману, Специфическое расщепление можно производить химическими или ферментатнвным методами. Так, Б. Уиткоп (В. >>((11(>ор) и Э. Гросс (Е. Сгом) обнаружили, что бромистый циан (С!чВг) расщепляет полнцептидную цепь только по псптидной связи, образованной карбокснльной > руппой остатка метиаиини (рис. 2.29).
Если в белке содержится 10 метиониновых остатков, то после обработки бромистым цианом обычно получается 11 пептидов. Высокоспспнфическое расщепление достигается также с помощью трипсина- протеолитического фермента поджелулочной железы, Трипсин расщепляет полипептилные цепи по псптидной связи, образованной кврбоксильной группой ос>агков аргинина и лизина (рис.
2.30). В результате белок, содержащий 9 остатков лизина и 7 остатков аргиннна, после расщепления >рипсином распадается на >7 пептидов. Каждый из этих пептидов, кроме пептнда, расположенно>о на карбоксильном конце белка, будет кончаться аргинином илн лизином. Ряд других способов специфического расщепления полипецтилных цепей цривелен в табл, 2.2.
Пецтнды, полученные при специфическом химическом или ферментативном расщеплении белка, разделяют методами хроматографии. Далее последовательность аминокислот в каждом из пептидов определяют методом Эдмана. Таким образом, достигается этап, когла последовательность аминокислот в отдельных пептидах (фрагментах белка) известна, но остается невыясненной последовательность самих псптидов. Последнюю устанавливают с помощь>о > ак называемых перс«рыками(ихся лецо>ядов (рис. 2.31). При этом испальзук>т уже нс тринсин, а какой-либо фермент, рас>пепляющий полипептидную цепь в других участках, например хнмотрипсин, который расщепляет пептилные связи главным образам по двгрйддция по эдмдну ~ "г г — 2 — ( 3Я4Я5) ') р-!г' — г — КгН )-.Я ~~~>-, з т г -ДЗ-Щ-Щ ~;>- 2 -С2) — С4ЯЬ) — 2 ( 3Я4у — Сбу Первый цикл Отщелление Мвчвиив Втсрои цикл Феннлнвотиоцнвнат ,Π— 6!у — Аер — Р)ге — Аго — О~у — С О Гч=С=Б+ Мечение Π— 6)у.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
