М.В. Медведева - Основные принципы колоночной хроматографии. Гель-фильтрация (1123328), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Подумайте, какими способами мож но точно определить, докакого уровня необходимо залить суспензию сорбента в колонку,чтобы его объем составил 45 мл, если диаметр данной колонки 1,5 см.4) Дайте суспензии осесть и при необходимости добавьте еще порциюсорбента, взмутив стеклянной палочкой верхний слой уже осевшегоносителя и открыв колонку снизу. Чтобы во время хроматографии30верхний слой сорбента не взмучивался, на него можно положитькружок из фильтровальной бумаги.5) Плотно закройтекрышку колонки так, чтобы колонка былаполностью герметична.6) Подсоедините колонку к перистальтическому насосу (или к склянке снижним тубусом), с помощью которого вы будете задавать скоростьтока жидкости через колонку, и пропустите небольшой объемэлюирующего раствора, чтобы сорбент слегка уплотнился и его объемперестал изменяться.7) Определите скорость тока жидкости через колонку.
Оптимальнаяскорость для данного разделения (при диаметре колонки 1,5 см) - 2025 мл/ч. Убедитесь, что ваша колонка выдерживает такую скорость(уровень жидкости и сорбента в колонке должны быть постоянными).Основные требования к работе с гель-фильтрапионной колонкой:-в носителе не должно быть пузырей воздуха-не допускайте резких перепадов давления-не пересушите гель-при любых действиях с колонкой предварительно закрывайтенижний кран.2. Нанесение белка на колонку.1) Выключите перистальтический насос, закройте кран внизуколонки и откройте крышку.2) Аккуратно автоматической пипеткой отберите жидкостьнадверхним слоем сорбента (над фильтровальной бумагой) или дайте емувпитаться, открыв кран снизу. Следите за тем, чтобы верхний слойсорбента при этом не пересох (оставьте 2-3 мм слоя жидкости). Закройтекран.3) Нанесите на колонку 0,7 мл смеси разделяемых веществкруговыми движениями по внутренним стенкам колонки с помощьюавтоматической пипетки.4) Дайте смеси впитаться, открыв кран снизу.
С этого моментаначинайте собирать элюат в мерную пробирку (пробирка № 1).5) Закройте кран. Наслоите элюирующий раствор (1,0-1,5 мл) насорбент, обмывая стенки колонки, и снова дайте ему впитаться. Элюатсобирайте в ту же мерную пробирку. Пробирки пронумеруйте.6) Еще раз наслоите 1,0-1,5 мл элюирующего раствора на сорбент,закройте колонку, подключите ее к перистальтическому насосу ипродолжайте элюцию со скоростью 20-25 мл/ч. В пробирку №1 соберите~7 мл элюата (практически до начала элюции голубого декстрана). Далееэлюат фракционируйте в мерные пробирки по 2 мл (при определенииобъема фракций элюата мениск должен находиться на уровне глаз). Сборфракций заканчивайте после «выхода» хромата калия, но колонкупродолжайте промывать элюирующим раствором, чтобы отмыть гель от31неспецифически сорбированных на нем веществ.
В идеале нужнопропустить через колонку 2-3 объема элюирующего раствора.Практически сразу после начала элюции видно, что на колонкеначинается разделение нанесенной смеси веществ.3.Построение профиля элюции веществ, разделенныхрезультате гель-хроматографии.1) Для построения профиля элюции измерьте величину оптическогопоглощения полученных в результате хроматографии фракций наспектрофотометре. Фракции голубого декстрана спектрофотометрируйтепри 670 нм ( А ол%62о нм = 0,89-0,95), а фракции, содержащие цитохром с ихромат калия - при 425 нм.
(Подумайте, почему оптическое поглощениепредлагается измерять при этих длинах волн, а не в максимумахпоглощения голубого декстрана и цитохрома с). Объем пластиковойкюветы - 1 мл, длина оптического пути - 1 см. В качестве контрольногораствора используйте элюирующий раствор.2) Данные измерения оптической плотности внесите в таблицу 4 ипостройте по ним профиль элюции разделяемых веществ - зависимостьвеличины оптического поглощения, пропорционального концентрациивещества в пробе, от объема элюции.3) По профилю элюции определите величины V0, Ve и V;, где VDобъем элюции голубого декстрана, Vei - объем элюции цитохрома с, a Vc2= V| - объем элюции хромата калия.4) Отметьте на колонке маркером уровень геля.
Закончите промывкугеля в колонке. С помощью шприца выбейтегель из колонки встаканчик. Определите общий объем V, колонки. (Это мож но сделатьдвумя способами. Предложите, какими).5) Рассчитайте величину Kav для цитохрома с и хромата калия поформуле ( 10).6) Промойте колонку и все шланги дистиллированной водой.7) Сделайте выводы из полученных результатов.ОФОРМЛЕНИЕ ЗАДАЧИЗадачу оформите в соответствии со следующим планом:1) Название работы.2) Краткое теоретическое введение (не надо дословнопереписывать методическое пособие; необходимо описатьv принцип метода, который Вы используете в работе).3) Цель работы.4) Ход работы.4.1. Описание заполнения колонки с указанием объема колонки искорости тока элюирующего раствора;32в4.2. Подробное описание всех этапов нанесения и разделения смесивеществ.5) Результаты и их обсуждение.5.1.
Приведите заполненную таблицу 4, профиль элюции веществ иподробно опишите его;5.2. Приведите величины V0, Vei и Ve2 и результаты расчетов Kav дляцитохрома с и хромата калия.5.3. Постадийно проанализируйте результаты, полученные в ходехроматографии. Чем они отличаются от того, что вы ожидалиполучить? Если что-то не получилось, постарайтесь понять, почему.6) Выводы.Выводы должны в очень сжатой форме отражать полученные Вамирезультаты.Таблица 4. Объем фракций, полученных в результате гель______ ____хроматографии, и величины их оптического поглощения.№1234151617фракцииОбъем7222222фракции,млОбщий791113объемэлюата,млДлина620620620425425425425волны,нмОптич.поглощ.(А)33.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
