М.В. Медведева - Основные принципы колоночной хроматографии. Гель-фильтрация (1123328), страница 4
Текст из файла (страница 4)
8). На разрешение пиков при гель-хроматографии влияютмногие факторы: объем наносимого образца, соотношение объемов образца иколонки, размеры колонки, размеры частиц геля и их пор, плотностьупаковки геля в колонке, скорость тока элюента, вязкость образца и элюента,и др. Наиболее значимыми из них являются объем исследуемого образца иразмеры гель-фильтрационной колонки.Плохое разреш ениеХорош ее разрешениеКонц-цияКонц-цияОбъем элюцииаОбъем элюциибРис. 8. Схематическое изображение плохого (а) и хорошего (б) разрешенийпиковразделяемыхвеществприхроматографии.(поFhttp://sbio.uct.ac.za/Sbio/postgrad/modules/GRD/chromatographv/gf3.phplсизменениями.2.2.Применение гель-хроматографии.
Гель-хроматографию можноиспользовать для решения двух основных задач:1) для отделения группы мелких молекул от группы молекул с высокоймолекулярной массой;2) для фракционирования биополимеров с различной молекулярноймассой (фракционирование с высоким разрешением) и для определениямолекулярной массы макромолекул.2.2.1.Разделение групп веществ. Часто гель-хроматографиюиспользуют длябыстрого удаления из растворов макромолекулнизкомолекулярных соединений. В качестве примеров такого типаразделения можно привести обессоливание белков и смену буфера,освобождение от радиоактивных предшественников и детергентов, очисткунебольших белков от ДНК и других высокомолекулярных соединений и т.п.Для «группового разделения», как правило, используют относительножесткие, мелкопористые матрицы с крупными гранулами, позволяющимисущественно увеличить скорость тока раствора через носитель (например,сефадексы G-10, G-25 или биогель Р-6) (см.
ниже). При таком разделении18объем образца, наносимого на колонку, может достигать 20-30% от общегообъема колонки (Vt). В свою очередь, сама колонка может быть относительноширокой и короткой: отношение высоты колонки (h) к ее диаметру (d) - 10:1и даже ниже. На рис. 9 представлен типичный профиль элюции приобессоливании белка. Большие молекулы белка элюируются в свободномобъеме (или сразу после свободного объема) колонки (V0). Для хорошоупакованной колонки свободный объем равен -30% от общего объемаколонки. Маленькие молекулы соли двигаются по колонке медленнее,задерживаясь в гранулах геля, но не разделяются друг от друга.
Объем ихэлюции составляет —2/3 от общего объема колонки (рис. 9) и определяется поэлектропроводности элюирующего раствора.Рис. 9. Обессоливание белка методом гель-фильтрации. 1 - элюция белка(оптическое поглощение при 280 нм), 2 - электропроводность (mS) по[http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/GE_gelfiltration.pdflсизменениями.2.2.2.Фракционирование «с высоким разрешением».
Этот методиспользуют для получения индивидуальных компонентов смеси, дляотделения мономеров от агрегатов (что трудно бывает достичь с помощьюдругих видов хроматографии), а также для определения молекулярной массы19молекул. Чаще всего этот подход используют для разделения смеси белков иопределения их молекулярной массы.Ввидуотносительнонизкой(посравнениюсдругимихроматографическими методами) эффективности, этот способ разделенияиспользуют, когда число компонентов смеси невелико, как правило, напоследних стадиях выделения и очистки. При этом колонка должна бытьузкой и длинной (отношение h:d - 20:1- 100:1), а объем наносимого наколонку образца зависит от состава разделяемой смеси и должен лежать вдиапазоне 0,5-4% от общего объема колонки (как правило, 52%).Для того чтобы уменьшить объем образца до нужного объема, егобывает полезно сконцентрировать.
Однако концентрация в нем не должнапревышать 70 мг/мл, поскольку на эффективность разделения будетнегативно влиять вязкость раствора разделяемой смеси.На качество разделения в процессе хроматографии будет также влиятьскорость элюции. Если при обессоливании белковых фракций скоростьэлюции может быть довольно большой (-2 0 мл/см2-ч) (если, конечно, гель небудет при такой скорости сжиматься), то при фракционировании белковскорость элюции желательно значительно снизить.
Она не должна бытьслишком высокой, так как в этом случае не будет хватать времени длядостижения полного равновесия между подвижной и неподвижной фазами,что приведет к недостаточно эффективному разделению белковых зон. В тоже время слишком медленная скорость элюции не только удлинит процессхроматографии, но и вызовет уширение белковых пиков за счет продольнойдиффузии и, как следствие, также приведет к плохому разделению белков.Оптимальную скорость элюции можно найти в соответствующихсправочниках или подобрать экспериментально.Для разделения смеси белковых молекул, не сильно различающихся поразмеру, и определения их молекулярной массы важно, чтобы величины ихмолекулярных масс лежали в области эффективного фракционирования.Диапазон размера молекул, которые могут быть разделены на данномсорбенте, называется селективностью сорбента, а зависимость величиныKav разделяемых веществ от логарифма их молекулярной массы - кривойселективности (рис.
10). Обычно эта кривая линейна в диапазоне Kav от 0,1до 0,7 (рис. 10). Селективность гелей, также как и предел исключения(предел эксклюзии) - предельная молекулярная масса частицы, ещепроникающей в поры геля, как правило, указывается в справочниках иинструкциях, прилагаемых к хроматографическим носителям фирмамипоставщиками.Если особый интерес при разделении молекул представляетконкретный компонент смеси, лучше выбрать такой сорбент, для которогологарифм его молекулярной массы попадает в середину кривойселективности.20область фракционированияРис. 10. Схематическое отображение селективностисорбента прифракционированиибелковметодомгель-хроматографии(криваяселективности)(по rhttp://sbio.uct.ac.za/Sbio/postgrad/modules/GRD/chromatographv/gf3.pgpl сизменениями.2.2.2.1.Определение молекулярной массы белков с помощью методагель-фильтрации.
Часто гель-хроматографию применяют для определениямолекулярной массы биополимеров, особенно белков. Для этого через гельфильтрационную колонку пропускают набор белков с известноймолекулярной массой и определяют величины их Kav. Строят калибровочныйграфик зависимости Kav этих белков от десятичного логарифма ихмолекулярных масс (этот график, как правило, линеен для глобулярныхбелков) (рис.
11). Определив экспериментально величину Kav дляисследуемого белка, по такому калибровочному графику можно рассчитатьего молекулярную массу. Однако такой подход довольно приблизителен игодится лишь для глобулярных белков одинаковой плотности.Log МРис. 11. Зависимость Kav от десятичного логарифма молекулярной массыбелка (кДа). (Калибровочный график для определения молекулярной массыбелка).2.3.Сорбенты для гель-хроматографии.
Как уже упоминалось выше,для создания пористых гранул используют полимерные гели. Различныекоммерческие носители позволяют разделить биомолекулы с молекулярными21массами от 0,1 до 8000 кДа. Среди сорбентов наиболее широкое применениенашли сефадексы, супердексы, молселекты, сефакрилы, сефарозы, суперозы,биогели, ультрогели, Toyopearl HW.Сефадекс1 - полисахарид декстран, обработанный эпихлоргидрином,СН2— СН2— СН2С1\/Озасчетчегообразуютсямногочисленные поперечные сшивки (рис.12), приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен,нерастворимых в воде.
Сефадексы - относительно мягкие гели, легкосжимаются, а в водных растворах сильно набухают. Изменяя долю сшивки,можно варьировать средний размер пор, образуемых пространственнойсеткой сшитого геля, и, соответственно, жесткость геля (чем меньше сшивок,тем мягче гель) и интервал фракционирования. Сефадексы устойчивы при pH2-12 в присутствии мочевины и детергентов, в органических растворителях,но разрушаютсявсильныхкислотах и в результате длительноговоздействия окислителей.Существует много сорбентов на основе декстрана - от самыхмелкопористых (сефадекс G-10) до наиболее крупнопористых (сефадекс G200) (табл.
2). Чем крупнее поры, тем больше молекул воды связывается сгелем при его набухании. Номер в маркировке сефадекса характеризуетего пористость и означает количество воды (в мл), которое связываетсяс 10 г сухого геля. Помимо величины пор, сефадексы отличаются поразмерам самих сферических гранул.Молселект - матрица для гель-фильтрации с аналогичными сефадексусвойствами, выпускавшаяся венгерской фирмой «Reanal».Супердекс - сорбент, представляющие собой поперечно сшитые нитиагарозы и декстрана. По своим свойствам похож на сефадекс, однакообладает большей прочностью (выдерживает более высокое давление).Сефакрил сочетает в себе свойства сефадекса и полиакриламидногогеля (ПААГ), т.к. нити декстрана в нем сшиты метиленбисакриламидом, чтопозволяет получить жесткие гели, пористость которых легко контролировать(рис.
13). Сефакрил гидрофилен, химически инертен, термостабилен и можетиспользоваться при более высоких скоростях элюции, чем сефадекс с той жепористостью.Сефакрилыприменяютсяглавнымобразомдляфракционирования и очистки крупных молекул (плазмид, рибосом, вирусов,фрагментов ДНК, белков с большой молекулярной массой) и не могутзаменить сефадексы малых номеров.Сефароза - матрица, выпускаемая в виде суспензии на основе гелейагарозы (рис. 14). Гели сефарозы достаточно жесткие, но уступают по этомусвойству сефакрилам. Гранулы сефарозы легко крошатся при неосторожном'С ефадекс (Sephadex) - коммерческий препарат, получивший свое название от начальныхслогов: separation (разделение), Pharm acia (наименование шведской фармацевтическойфирмы), dextran (декстран).22Таблица 2. Сефадексы, применяемые для гель-хроматографии.СефадексыДиапазон фракция белковПределэксклюзии(декстраны)<700 ДаПрименение ифракционируемыесоединенияG-10<700 ДаОбессоливание, сменабуфера; разделениеочень низкомолекулярныхсоединений,пептидовG-15<1,5 кДа<1,5 кДаОбессоливание, сменабуфера; разделениенизкомолекулярныхсоединений,пептидовG-251-5 кДа0,1-5 кДаОбессоливание, сменабуфера; разделениемаленьких пептидов ибелков; отделение меченныхбелков и ДН К от свободнойметкиG-501,5-30 кДа0,05-10 кДаОбессоливание, сменабуфераG-753-80 кДа1-50 кДаРазделение белковG-1004-150 кДа1-100 кДаРазделение белков,оптимален для определениямолекулярной массыG-1505-300 кДа1-150 кДаРазделение белковG-2005-600 кДа1-200 кДаРазделение белков* Сефадексы могут различаться размерами самих сферических гранул и делятся наследующ ие классы:С (coarse): 100-300 мкм (используются для очень грубых образцов)М (medium): 50-150 мкм (используются для стандартной лабораторной работы)F (fine): 20-80 мкм (используются для препаративной лабораторной работы)SF (superfine): 10-40 мкм (используются для высококачественного разделения, нохарактеризуются низкой скоростью тока).перемешивании, не выдерживают температуры выше 40°С и замораживанияоттаивания, не отличаются химической стойкостью, но устойчивы в водныхрастворах при pH 4-9.
«Сшивки» нитей агарозы 2,3-дибромпропанолом (рис.146) придают сефарозе химическую, термическую и механическуюустойчивость и большую жесткость, что позволяет увеличить скоростьэлюции. Однако они никак не сказываются на области фракционированиямолекул, которая для «сшитой» и обычной агарозы практически совпадает.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
