М.В. Медведева - Основные принципы колоночной хроматографии. Гель-фильтрация (1123328), страница 2
Текст из файла (страница 2)
3).В идеальном случае пик имеетколоколообразнуюформу,описываемую кривой статистического распределения Гаусса. Однако напрактике это далеко не всегда так. Чаще пик имеет более или менеезначительные отклонения от классической формы. Это явление называетсяасим м ет рией пика и при хроматографическом разделении крайненежелательно. Причин такой асимметрии существует множество, но чащевсего она связана с наличием помимоосновного механизма сорбциидополнительных взаимодействий вещества с носителем, а также с наличием вразделяемой смеси разных форм одного и того же сорбата, которые способныпревращаться друг в друга в соответствии с константой равновесия междуэтими формами.
На практике это наиболее часто приводит к затянутому7КоНЦ-Ция (отн. ед)Время элюции (мин) / Объем элюции (мл)Рис. 3. Хроматограмма разделяемых на колонке соединений с пиками ихэлюции (1-3). По оси абсцисс откладывают время элюции, объем элюции илиномер фракции; по оси ординат - концентрацию разделяемыхвеществ походу хроматографии или величины, им пропорциональные, например,оптическое поглощение элюента (по [http://krauthammerlab.med.yale.edu...] сизменениями).заднему фронту пика, который на хроматографическом «сленге» называют«хвостом», что может существенно сказаться на качестве разделениявеществ.
В этом случае устранить асимметрию пика можно, кардинальноизменив свойства хроматографической системы, например, откорректировавсостав элюента и/или подобрав другой сорбент. Гораздо реже происходитуширение переднего фронта (на сленге - «борода», «живот», «нос»), одной изпричин которого может быть перегрузка сорбента разделяемым образцом. Вэтом случае достаточно снизить количество наносимой на колонку смесивеществ, чтобы пик приобрел классическую форму.Совокупность всех пиков разделяемых веществ, полученных врезультате хроматографии, представляет собой профиль элюции (рис.
3), аего графическое изображение называется хроматограммой. При идеальномразделении каждому пику на хроматограмме соответствует одноиндивидуальное вещество, первоначально присутствующее в смеси.Как уже отмечалось, за процессом элюции следят, измеряяконцентрацию исследуемого вещества на «выходе» из колонки, если этовозможно, по изменению оптической плотности элюента.
В началехроматографии, когда вещество еще не начало элюироваться, или в концехроматографии, когда вещество уже проэлюировано с колонки, егоконцентрация в элюате будет равна нулю, и поэтому на хроматограммебудет регистрироваться нулевая или базовая линия. Площадь, ограниченная8на хроматограмме пиком и базовой линией, является количественной меройсодержания данного компонента в смеси.Время, прошедшее с момента начала разделения до появлениямаксимума пика на хроматограмме называют временем удерж ания tr.
Этавеличина наряду с шириной и формой пика является основнойхарактеристикой, на базе которой проводят идентификацию вещества нахроматограмме и оценивают качество разделения. Другой важнойхарактеристикой хроматографии является удерж иваемый объем - объемэлюента, который необходим, чтобы элюировать («вымыть») с колонкиданное вещество i. Эту величину легко рассчитать по формуле (3), знаяобъемную скорость движения элюента в колонке (мл/мин или мл/час) ивремя удержания вещества i:Vi = v t rгде(3)Vj - удерживаемый объем вещества (мл)tr - время удержания вещества на колонке (мин или час)v - скорость элюции (мл/мин или мл/час)Хотя сорбент и растворитель распределены по всей колонкеравномерно, колонку можно представить как совокупность дискретныхслоев, в каждом из которых устанавливается равновесие в распреденениивещества между подвижной и неподвижной фазами.
Такой воображаемыйэлемент колонки называется «теоретической тарелкой».Размывание хроматографической зоны приводит к уширению пика нахроматограмме. Степень размывания количественно характеризуетсявеличиной эффективности, т.е. способностью к образованию узкойконцентрированной зоны индивидуального компонента разделяемой смеси ввыбранных условиях для данного сорбента. Эффективность разделениязависит от так называемого числа теоретических тарелок N. Величинуэффективности N рассчитываются по формулам (4) и (4а):N = 16(tr/W b)2 = 5,545 (tr/W h)2(4)N = 5,545 (tr/Atx)2(4а)ИЛИгдеtr - время удержания пика веществаAtx - время элюции пика от половины его высоты на подъеме дополовины высоты на спаде (полуширина пика)Wb - ширина пика на его полувысотеWh - ширина пика у основанияВысоту, эквивалентную теоретической тарелки Н, можно рассчитать поформуле (5), зная длину колонки:(5 )Н = L/NгдеL - длина колонкиN - число теоретических тарелокОбе величины N и Н имеют вероятностно-статистический характер ивполне конкретный физический смысл, который можно определить для N какчисло элементарных актов сорбции-десорбции, произошедшей с веществомпри его движении по колонке, а для Н - как высоту слоя в колонке, накотором происходит единичный акт сорбции-десорбции.
Из формулы (5)следует, что эффективность прямо пропорциональна длине колонки.Представим, что 256 идентичных молекул вещества А, которыеравномерно распределяются между подвижной и неподвижной фазами,нанесены на колонку с 20 теоретическими тарелками (табл. 1). В верхней(начальной) теоретической тарелке 256 молекул распределяются так, что вкаждой фазе находится по 128 молекул. При переходе подвижных молекул спервой теоретической тарелки на вторую, они распределяются на ней по 64 вподвижной и неподвижной фазах.
Оставшиеся на первой теоретическойтарелке 128 молекул неподвижной фазы в силу динамического равновесияперераспределяются по 64 в каждой фазе, как показано в таблице 1. Припродвижении подвижной фазы еще на одну теоретическую тарелку сновапроисходит перераспределение. Распределение вещества А по колонке вподвижной фазе после 20 последовательных переносов представлено нарисунке 4 (правый пик).Одновременно с молекулами вещества А на колонку нанесем также 256молекул другого вещества Б, сродство которого к неподвижной фазесущественно выше, и его молекулы распределяются между подвижной инеподвижной фазами в соотношении 1:3.
Из таблицы 1 и рисунка 4 видно,что в результате 20 переносов молекулы вещества Б будут по-другомураспределяться по колонке. В результате можно достичь существенногоразделения веществ А и Б в процессе хроматографии. Очевидно, что чембольше число теоретических тарелок (т.е. длина колонки), тем лучшеразделяются молекулы веществ А и Б на колонке (в том случае, когдаразделение определяется только распределением).
Так увеличение высотыколонки в 2 раза приводит к улучшению разделения пиков в 1,4 раза, т.е. на40%.На эффективность разделения в первую очередь влияют:1) Основные свойства применяемого сорбента и качество заполненияколонки.2) Условия хроматографии', температура, скорость потока элюента,его состав и химическое строение разделяемых веществ.
Напрохождение акта сорбции-десорбции нужно определенное время. Поэтой причине, чем больше скорость потока элюента, тем большеразмывание. Понижение температуры и увеличение молекулярноймассы сорбатов будет замедлять установление равновесия. Поэтому10Таблица 1. Принцип действия колонки, в которой разделение основано нараспределении *.____________ _______________________ ______________________№теор.тарки123№теор.тарки1-й переносИсходноИсходно256256молекулмолекулп.ф.1281:1н.ф.128п.ф.641:3н.ф.1928-й переносИсходноИсходно256256молекулмолекулп.ф.1721353521711:1н.ф.172135352171п.ф.92120104101:3н.ф.25606032и212-й переносИсходноИсходно256256молекулмолекулп.ф.64641:1н.ф.6464п.ф.48161:3н.ф.1444813-й переносИсходноИсходно256256молекулмолекулп.ф.0026152428241562101:1н.ф.002615242824156210п.ф.21015141263111:3н.ф.630464235148423-й переносИсходноИсходно256256молекулмолекулП.ф.3264321:1н.ф.326432п.ф.362441:3Н.ф.108721220-й переносИсходноИсходно256256молекулмолекулП.ф.00000126121822221812621001:1н.ф.0000012612182222181262100п.ф.0151012121074211:3н.ф.0617303636311911431234567891011121314151617181920* Гипотетическая колонка разделена на 20 теоретических тарелок.
На колонку нанесено512 молекул. Из них 256 молекул вещества А, которые распределяются между подвижной(п.ф.) и неподвижной (н.ф.) фазами в соотношении 1:1 (жирный шрифт) и 256 молекулвещества Б, которые распределяются между подвижной и неподвижной фазами всоотношении 1:3 (курсив). В процессе элюции оба вещ ества в подвижной фазе переходятна следующ ую теоретическую тарелку.
После каждого переноса число молекул веществ Аи Б распределяется между подвижной и неподвижной фазами в соотнош ении 1:1 и 1:3,соответственно. Незначительное отклонение общего числа молекул от их суммарногоколичества связано с округлением цифр при расчетах. Подробные объяснения см. втексте.Число молекултНачало хроматографииРис. 4. Распределение молекул двух различных веществ А и Б погипотетической хроматографическойколонке, состоящейиз 20теоретическихтарелок,после20переносовпоrhttp://www.connecticutvallevbiological.coml с изменениями. (См.
объясненияв тексте).3)4)5)6)при понижении температуры или при разделении веществ с большоймолекулярной массой приходится уменьшать скорость элюции.Пристеночный эффект, заключающийся в том, что скорость потокаэлюента у стенок колонки гораздо ниже, чем в ее центре (поэтомупрофиль скоростей элюента по сечению колонки имеет формупараболы).Система каналов, образуемых сорбентом в колонке, через которые ипротекает элюент. Чем мельче и ближе друг к другу по размерамчастицы сорбента, тем более одинаковые пути проходят в колонкемолекулы элюента и, соответственно, меньше разница во времени дляпроходящих через колонку молекул одного компонента.Продольная и поперечнаядиффузия разделяемых веществ вподвижной и неподвижной фазах, влияющая на скорость единичногоакта сорбции, особенно при наличии тупиковых пор в сорбенте (поэтой причине, чем больше скорость тока, тем меньше размывание).Особенности конструкции колонки, соединительных узлов, шлангов икювет детектора, регистрирующего концентрацию вещества вэлюате.
Эти факторы обуславливают внеколоночное размываниехроматографических зон и также снижают общую эффективностьразделения.В зависимости от принципов разделения веществ выделяют несколькоосновных типов хроматографии (деление достаточно условно). Этоадсорбционная,распределительная,ионообменнаяиаффиннаяхроматографии (принципы этих видов хроматографий подробно изложены в12методическом пособии «Методы разделениябелком»), а также гель-хроматография.иочистки1UUpNMDIA2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
