М.В. Медведева - Основные принципы колоночной хроматографии. Гель-фильтрация (1123328), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Вфирменном обозначении на наличие сшивок указывают буквы «CL» («crosslinked»).23Рис. 12. С труктурная ф орм ула сеф адекса (по [Pharm acia Fine C hem icals]).н Л I С != 00= С1м1нСН,СИ*я\ н -СНц— CHj— СН— CH j— с н ^^СН*CHf—O-Рис. 13. Структурная формула сефакрила (по [Pharmacia Fine Chemicals]).ейО /бРис. 14.
Структура «простой» (а) и «сшитой» CL (б) агарозы (по [PharmaciaFine Chemicals]).Многократно сшитые нити агарозы получили в последнее время новоеназвание - суперозы. Они выдерживают на порядок большее давление, чемагароза и стабильны при pH 2-14.Свойства биогелей серии А - носителей, выпускаемых также на основегелей агарозы фирмой «Bio-Rad» (США) - аналогичны свойствам сефарозы.Марки гелей различаются диаметром гранул и процентом агарозы, которыйопределяет область фракционирования белков. Macro-Prep SE гели, в основекоторых сферические (с диаметром -4 0 мкм) поперечно-сшитые гранулывысокоочищенной агарозы обладают большей механической и химическойстабильностью, а также разрешающей способностью.Помимо гелей на основе агарозы фирма «Bio-Rad» выпускаетсферические матрицы на основе полиакриламидных гелей (ПААГ) (рис.
14) биогели серии Р, в которых пористость геля определяется концентрациейакриламида. В зависимости от марки геля могут также варьировать размерыгранул. Свойства этих гелей во многом сходны со свойствами сефадексов.со—СН2—СН— [СНг—СН—]„—СНг—СН—1СН 2—СН—1^-СНг—IIсоСОIсоIIINH2NHNH2Iсн 2INHICOI—CH2—CH—[CH2—CH—]„—CH2—CH—[CH2—CH—]„—CH2—IIICOCOCOIIINHNH2NH2ICH2INHICOI—СНг—CH—[CH2—CH—]„—CH 2—CH—[CH 2—CH—]„—CH2—ICOIICOCOРис.
15. Структура полиакриламидного геля.Ультрогели серии А - сферические агарозные сорбенты, мало чемотличающиеся от сефарозы, в то время как ультрогели серииА сА(«acrylamide-agarose»), получаемыезасчетполимеризациисеткиакриламидного геля внутри жесткого каркаса агарозы, обладаютдополнительнойжесткостьюприсохранениивозможностифракционирования относительно низкомолекулярных веществ. Жесткостьсорбента дает им преимущества перед биогелями серии Р, однако для нихсохраняютсяограниченияработыприповышеннойтемпературе,свойственные агарозе.Toyopearl H W - полужесткий гель (TSK) японской фирмы «Toyo-Soda»,представляющий собой сферические гранулы сополимера этиленгликоля иметакрилата, содержащего много гидроксильных групп.
Этот гельсущественно отличается от гелей на основе декстрана, агарозы иполиакриламида своей механической устойчивостью, что позволяетзаполнять им колонки под давлением (с помощью перистальтического26насоса), а также элюировать вещества с достаточно высокой скоростью.Носители Toyopearl химически устойчивы к кислой и щелочной среде.Одним из существенных недостатков TSK-гелей является то, чтобольшое количество гидроксильных групп способствует образованиюводородных связей между носителем и разделяемыми белками, вызываянеспецифическую сорбцию некоторых из них на геле. Однако это свойствоносителя можно использовать для очистки некоторых белков на TSK-гелях(например, HW-65fine) по типу адсорбционной хроматографии.Частичная сорбция белков (и как следствие — замедление их элюции)возможна не только на TSK-гелях, но и на других носителях.Наиболее подходящими для фракционирования белков являютсясефадексы G-75-S-200, биогели Р 60+200, ультрагели серии АсА 34+54 и т.д.По возможности следует выбирать сорбенты с гранулами наименьшихразмеров (для сефадексов, например, это категории «Fine» и «Superfine»,поскольку для таких носителей быстрее наступает равновесие междуподвижной и неподвижной фазами.
Однако возможная скорость токараствора через колонку с такими носителями меньше, чем для сорбента сболее крупными гранулами. Кроме того, при выборе носителя следуетучитывать возможность сорбции белков на матрице геля.2.4. Подготовка носителя к работе. Если носитель представляетсобой водную суспензию (сефарозы, ультрогели АсА, биогели серии А), егоподготовка к работе сводится к удалению консервирующих добавок иуравновешиванию буфером (или другим раствором). Сухие носители(сефадексы, биогели серии Р) должны хорошо набухнуть в воде или буфере.Для этого нужное количество сухого геля при перемешивании высыпаюттонкой струйкой в стакан с жидкостью (не наоборот, т.к.
могут образоватьсякомки). Пользоваться для перемешивания магнитной мешалкой не следует,т.к. гранулы могут разрушиться. Время набухания гелей в водных растворахразлично и зависит от величины его пор (для набухания сефадексов G-10 G-50 при комнатной температуре требуется 3 часа, G-75 - сутки, и т.д.).Ускорить процедуру набухания можно нагреванием.2.5. Заполнение колонки, нанесение разделяемых веществ и ихэлюция.При гель-фильтрации, как ни при каком другом виде хроматографии,для хорошего разделения важна однородность заполнения колонки. Передзаполнением колонки суспензию геля и элюирующий раствор лучшедеаэрировать, чтобы пузырьки воздуха не нарушали однородность сорбента.Кроме того, очень важно:1) не допускать пересыхания геля в процессе заполнения колонки;2) исключить одностороннее нагревание или охлаждение колонки;3) выбрать оптимальный перепад давления на колонке и скорость элюции,т.к.
некоторые не очень жесткие матрицы (сефадексы G-100, G-150, G-200,сефарозы 6В, 4В, 2В, биогели и др.) могут деформироваться и сжиматься;4) избегать взмучивания верхнего слоя геля при нанесении смеси веществ наколонку и в процессе элюции (для этого на поверхность геля можно27положить кружок фильтровальной бумаги или использовать колонки садаптерами).Качество заполнения колонки легко оценить, пропустив через неесвежеприготовленный 0,2-0,5%-ный раствор голубого декстрана полисахарида с молекулярной массой -2000 кДа.
Искривление, перекос иискаженные границы окрашенной зоны будут указывать на несовершенствозаполнения колонки. Одновременно такая процедура позволит определитьсвободный объем колонки VG(см. выше).Наносимый на колонку образец должен быть абсолютно прозрачным.При необходимости его следует отцентрифугировать или отфильтровать.Несмотря на то, что состав буфера не сильно влияет на разделениебелков методом гель-фильтрации, выбирая элюент для гель-хроматографии,нужно руководствоваться следующим. Элюент не должен: 1) оказывать нафракционируемые белки денатурирующего воздействия (изменять их формуи биологическую активность, вызывать диссоциацию белка на субъединицы,диссоциацию кофакторов от ферментов и т.п., за исключением специальныхэкспериментов); 2) влиять на материал сорбента; 3) способствовать сорбциибелков на материале носителя.
Все это приведет к аномальному поведениюмолекул при гель-хроматографии и скажется на разделении и значенияхопределяемоймолекулярной массы. Обычно состав буфера, егоконцентрацию и pHподбирают таким образом, чтобы сохранитьстабильность и активность разделяемых молекул. Часто в буфер добавляют0,15 М NaCl, чтобы избежать неспецифических ионных взаимодействийразделяемых молекул с материалом сорбента.
Однако в ряде случаев приопределении молекулярной массы белков бывает полезно добавить в буфертакие денатурирующие агенты как мочевину и гуанидинхлорид,разворачивающие белки и поддерживающие их в развернутой конформации.В этом случае определять величину Kav белков-стандартов для построениякалибровочной кривой следует в тех же условиях. Если впоследствиипредполагается лиофилизировать белковый препарат, удобно использоватьлетучие буферы, например, бикарбонат или ацетат аммония.2.6.Регенерация носителя.
Носители для гель-хроматографии можноиспользовать многократно. Для этого часто бывает достаточно пропуститьчерез колонку 2-3 объема буферного раствора или воды. В том случае, еслиесть опасения, что послезавершения элюции на матрице осталисьсорбированные белки, которые не элюируются буфером, через колонкуможно пропустить 1 М раствор NaCl, 8 М мочевину, раствор детергента, а внекоторых случаях (сефадексы, биогели Р) 0,5 М NaOH. Носители можнохранить в течение длительного времени в 2 М растворе NaCl или в 0,02%растворе азида натрия. Некоторые сорбенты (например, сефадекс) можновысушить.Если после многократного использования колонки скорость токажидкости через нее снижается, необходимо извлечь гель из колонки ипровести повторное заполнение колонки.28ЦЕЛЬ РАБОТЫ:Разделение смеси веществ, различающихся по молекулярной массе, методомгель-хроматографии.ЗАДАЧИ РАБОТЫ:1) Освоение приемов колоночной хроматографии и основнойхроматографической терминологии.2) Разделение голубого декстрана, цитохрома с и хромата калияметодомгель-фильтрациииопределениеосновныххроматографических параметров.Некоторые сведения о разделяемых веществах.Смесь веществ, подвергаемая разделению на гель-фильтрационнойколонке, состоит из трех компонентов: голубого декстрана, цитохрома с ихромата калия.
Их основные свойства приведены в таблице 3.Таблица 3. Основные свойства разделяемых веществ.НазваниесоединенияМол. масса, ЦветкДасоединенияГ олубойдекстран*-2 0 0 0Г олубойЦитохром-12,3КоричневыйМаксимумоптическогопоглощения,нм620412Класс соединенийполисахарид,конъюгированныйс красителембелокХромат0, 194ЖелтыйНет явнонеорганическаякалиявыраженногосоль(К2СЮ 4)максимума* - полисахарид, состоящий из остатков глюкозы, сшитых 1,6- и 1,3гликозидными связями, и конъюгированный с красителем реактивнымголубым 2 ;** - гем-содержащий белок, компонент электрон-транспортной цепи.29ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ (работа в паре)В основе данной практической работы леж ит задача, в течениемногих лет предлагаемая студентам на Малом практикуме по биохимии подруководством Г А .
Соловьевой.Реактивы:1. Сефадекс G-752. 0,9% раствор NaCl (элюирующий раствор) - 250 мл3. Смесь разделяемых веществ - 0,7 мла) голубой декстран - 4 мг/млб) цитохром с - 3 мг/млв) хромат калия К 2СЮ 4 —1,5 мг/млОборудование:1. Колонка (1,5 х 30 мл) на штативе со шлангами2. Перистальтический насос3. Стакан для элюирующего раствора или склянка с нижним тубусом4. Стакан на 50 мл для сефадекса5.
Стакан на 100 мл для элюата6. Мерные пробирки на 15 мл (20 шт.) в штативе7. Спектрофотометр8. Кюветы пластиковые на 1 мл с длиной оптического пути 1 см9. Стеклянная палочка10. Фильтровальная бумага11. Автоматическая пипетка 0,1-1 мл12. Ш приц на 10 мл1.Заполнение колонки.Для успешного разделения исследуемых веществ большое значениеимеет правильное заполнение колонки.1) Укрепите колонку в штативе строго вертикально.2) Закройте снизу кран и заполните колонку водой примерно на 1/3объема. С помощью шприца освободите пространство под пористымдиском от пузырьков воздуха.3) Через воронку или по палочке заполните колонку густой суспензиейтщательно взмученного сорбента (Сефадекс G-75) так, чтобы егоконечный объем составил ~45 мл (считаем, что объем колонки равен ~45 мл).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
