М.В. Медведева - Основные принципы колоночной хроматографии. Гель-фильтрация (1123328), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Гель-хроматография.Более 40 лет гель-хромат ография играет ключевую роль в очисткебелков, полисахаридов и нуклеиновых кислот, поскольку является наиболеепростыми«мягким»способомхроматографическогоразделения,практически нечувствительным к колебаниям pH, концентрации ионовметаллов, коферментов и т.п. В зависимости от требований экспериментаразделение можно проводить в присутствии необходимых для биомолекулионов и кофакторов, детергентов, мочевины, гуанидинхлорида, при высокойи низкой ионной силе, при температуре от 0 до 37° С (и даже выше).2.1.Принцип метода гель-хроматографии.
Гель-хроматография непредполагает специфического сродства вещества к неподвижной илиподвижной фазам (более того, связывание разделяемых веществ с сорбентомкрайне нежелательно), и в отличие от всех других видов хроматографий,перечисленных выше, разделяемые молекулы при гель-хроматографии несвязываются с носителем.Колонку заполняют сферическими гранулами сорбента, которыеформируются из гидрофильного полимера, образующего пространственнуюсетку (рис. 56) и обладающего химической и физической стабильностью иинертностью (в первую очередь, у него должны отсутствоватьадсорбционных свойств).
Носитель уравновешивают буфером или другимраствором, который заполняет как сами пористые гранулы, так ипространство между ними. Размер пор зависит от типа гелей и определяетсячастотой поперечных сшивок полимера. Внутри гранул постоянно остаетсяжидкость, которая не «увлекается» потоком элюента. Таким образом, пригель-хроматографиинеподвижнаяфазапредставленажидкостью,находящейся внутри пористых гранул, а подвижная фаза - той же самойжидкостью, протекающей между ними.Переход молекул веществ из подвижной фазы в неподвижную иобратно за счет диффузии ничем не затруднен, тогда как внутри гранулдиффузия затруднена из-за столкновений молекул диффундирующеговещества с нитями сетки полимера. В процессе хроматографии крупныемолекулы не способны проникать внутрь гранул и элюируются с колонки спередним фронтом подвижной фазы - «фронтом элюции».
Коэффициентраспределения К для таких молекул равен нулю. Мелкие молекулы, легкодиффундирующие внутрь гранул, свободно распределяются междуподвижной и неподвижной фазами. Значение К для таких молекул близко кединице, и они элюируются с колонки позднее, чем крупные молекулы (рис.5). Для молекул средних размеров не весь объем гранул может бытьдоступен, поэтому они будут перемещаться вдоль колонки с промежуточнойскоростью: быстрее, чем мелкие молекулы, но медленнее, чем крупные(0<К<1). Таким образом, разделение молекул при гель-хроматографии будет13происходить в зависимости от их размера (рис.
5), поэтому метод гельхроматографии еще называют методоммолекулярных сит или гельфильтрацией. Хотя часто размеры молекул определяются их массами, приразделении белков методом гель-хроматографии нужно учитывать такжеформу их молекул, так как очевидно, что глобула будет проникать внутрьгранул иначе, чем вытянутая молекула.СМ ЕСЬ БОЛЬШИХИ МАЛЕНЬКИХМОЛЕКУЛ-Ч А С Т И Ц Ы ГЕЛЯСФЕРИЧЕСКАЯ ГРАНУЛАГЕЛЯМАЛЕНЬКИЕМОЛЕКУЛЫПРОНИКАЮТВНУТРЬГРАНУЛЫМАЛЕНЬКИЕМОЛЕКУЛЫБОЛЬШИЕ* МОЛЕКУЛЫаКРУПНЫЕМОЛЕКУЛЫНЕПРОНИКАЮТВНУТРЬ ГЕЛЯбРис. 5.
Разделение белков методом гель-хроматографии, а - Н а колонкунаносят смесь веществ, молекулы которых имеют различный размер (илиразличную молекулярную массу). Крупные молекулы не могут проникнуть вгранулы и первыми элюируются с колонки, мелкие молекулы проникают вгранулыизадерживаютсятам(по[http://www.mikeblaber.org/oldwine/bch5425/lect3l/lect3 1.htm] с изменениями;бгрануласорбентавразрезе(по[http://www.ccbcweb.net/archive/Col_Chroml.htm] с изменениями).Коэффициент распределения (К) (см. формулу 2) определеннойхроматографической зоны при гель-хроматографии (в отсутствие сорбциимолекул веществ, когда концентрация вещества в обеих фазах одинакова),можно представить отношением объемов подвижной и неподвижной фаз:VsК=(6)V0гдеVs - суммарный объем жидкости неподвижной фазы14внутри гранул, доступный для молекул данногоразмераVQ- объем подвижной фазы - свободного объемаколонки вне гранул (рис. 6)Долю внутреннего объема гранул, доступную для молекул данногоразмера, можно охарактеризоватьнеким коэффициентом Kd «коэффициентом доступности».
Тогда, если V, - полный внутренний объемвсех гранул, тоVs= K * V 0= K d «Vi(7)Очевидно, что для очень мелких частиц Kd= l и VS=V;. В другихслучаях его значения могут лежать в интервале 0<Kd< l. Величина Kd играетважную роль в характеристике процесса гель-хроматографии. Ее можноопределить для каждой группы молекул определенного размера, элюируемыхс колонки отдельным пиком.Объем элюента, «вышедшего» из колонки к моменту появления пикавещества (Ve), будет определяться по формуле:Ve = Vo + Vs= V 0 + Kd »Vi(8)Ve -V„Kd = ----------------Vi(9)Следовательно,Таким образом, величину Kj легко найти экспериментально.
Для этогоопределяют (рис. 6, 7): 1) Ve —объем элюента от момента нанесения образцадо достижения максимума пика исследуемого вещества (или, если пик неострый, как объем от начала внесения препарата на колонку до того момента,когда концентрация элюируемого вещества на выходе с колонки достигнет50% от своего максимального значения); 2) V0 - объем элюции оченькрупных молекул (на практике для определения V0 часто используютокрашенное вещество с молекулярной массой 2-106 Да- «голубойдекстран»). Эта величина называется «свободным объемом колонки» иопределяет общий объем внешнего растворителя, находящегося вне гранул(outsite); 3) Vi - объем элюции очень мелких частиц (например, ионов солей),для которых Kd= l. Эта величина характеризует объем растворителя внутригранул геля (inside).15ОптическоепоглощениеРис.
6. Хроматограмма разделяемых на колонке соединений 1 и 2 с пикамиих элюции. V0 свободный объем колонки вне гранул, Ve, и Ve2 удерживаемый объем веществ 1 и 2, соответственно, Vj - объем элюциимелких частиц или объем внутри гранул геля. По оси ординат откладываютконцентрацию разделяемых веществ по ходу хроматографии или величины,им пропорциональные, например, оптическое поглощение элюента (по[http://media.wiley.com/CurrentProtocols/ET/et0601-fig-0008-l-full.gif]сизменениями).Однако, поскольку никогда нельзя полностью исключить возможностьчастичной сорбции мелких молекул внутри гранул, на практике нередкопредпочитают использовать другой коэффициент - Kav (от англ.
- available),характеризующий движение хроматографической зоны вдоль колонки пригель-фильтрации и определяемый как:Ve-V0K a v = -------------------------------------------------------------------------------------------------------- ( Ю )V,-V0гдеV, - общий (total) объем колонки (рис. 6) (его легкоопределить как объем цилиндра или измерить,заполнив колонку водой).16VoV t-V oVtaВ ы сокаям ол. м ассаАV0Средняям ол. м ассаАН изкаям ол.
м ассалVtv t-v o1KavО1 .обРис. 7. а - Наглядная демонстрация параметров (заштрихованная зона)хроматографической колонки при определении величины Kav (по[http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/GE_gelfiltration.pdf]сизменениями); б - профиль элюции соединений с различной молекулярноймассой, полученный в результате гель-хроматографии, и соответствующиеим величины Kav (по [http://xray.bmc.uu.se] с изменениями).Величина Kav пропорциональна Kd, но зависит от конкретных условийэксперимента.Формула (10) служит определением K av и ниоткуда не следует.Поскольку (Vt-V0)>Vj, величина Kav всегда должна быть меньше или равна 1.Если на практике полученная величина K av> l (т.е. Ve>Vt), это скорей всегосвидетельствует о сорбции молекул вещества на носителе. Иногда сорбцияобусловлена ионными взаимодействиями, и тогда ее можно избежать,варьируя значение pH буферного раствора и/или увеличивая ионную силу.17Если сорбция обусловлена гидрофобными взаимодействиями, ионная силадолжна быть минимальной.Степень разделения веществ и соответствующих им пиков нахроматограмме называется разрешением, которое может быть плохим ихорошим (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
