Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 200
Текст из файла (страница 200)
Теперь, погяощзя свет с длиной волны 433 нм, СРР без фвуоресценции при 476 нм передает энергию напрямую ТРР который затем фауоресцирует на характерной длине волны 527 нм. Отношение интенсивностей излучения при 527 нм к таковой при 476 нм является мерой взаимодействия красного и фиолетового белков. Метод РКЕТ испольэовали для измерения кои пентрации сАМР в живых клетках. Ген СЕР слили с геном Регудяторной субъсдиницы (К) сАМР-зависимой протенпкинаэы, а ген В1'Р слили с геном катадитической субьединипы (С) (рис. 6). Ковда зги два гибридных гулирующими множество Саэ -зависимых ферментов. Кальмодудин (СаМ; М, = 17000)— кислый белок с четырьмя высокоаффинными Саэ'-связывающими центрами. Когда содержание Саэ' в клетке повышается до -10" М (1 мкМ), присоединение Саэ' к кальмодулину вызывает в этом белке конформационное изл1енение (рис.
12-11, а). Кадьмодулин связывается с множеством белков и при присоединении к нему Саэ' модулирует их активность (рис. 12-11, б). Кальмодулин — член семейства Саэ -связывающих белков, туда же относится тропонин (с. 247), инициирующий сокращение скелетных мышц в ответ на увеличение концентрации ионов кальция. Для этого семейства характерна Саэ'-связываюнтая структура — «ЕЕ-рука» (рис. 12-21, а). ~™Ы + ° ззо нет свечения Рис.
6. Измерение концентрации сАМР методом РВЕТ. В результате слияния генов создаются гибридные белки, между которыми возможен резонансный перенос энергии флуоресценции (РВЕТ), когда хаталитическая и регуляторная субъединицы РКА ассоциированы (низхзя концентрация сАМР). Когда содержание сАМР увеличивается, субьединицы расходятся, и РВЕТ прекращается. Отношение эмиссии при 460 нм (состояние диссоциации) х эмиссии при 545 нм (состояние коиплекса) служит чувствительной мерой концентрации сАМР.
Кальмодулин является также интегральной субъединнцей семейства ферментов, Саэ'/ кальмодулинзависимых протеинкиназ (СаМ- киназы 1-ГЪ'). Когда в ответ на какой-либо стимул внутрикдеточная концентрация Са' увеличивается, кальмодулин связывает Са', претерпевает конформационное излтенение и активирует СаМ-киназу.
Эта киназа затем фосфорилирует ряд ферментов-мишеней, регулируя их активность. Кальмодулин служит также регуляторной субъединицей мышечной киназы фосфорилазы Ь, которая активируется ионами Саэ'. Таким образом, Саэ' вызывает АТР- зависимые сокращения мышц, активируя в то же время и распад глнкогена, обеспечивающий «топливом» синтез АТР. Известно, что многие 12.2 Рецепторы, сопряженные с б-белком, и вторичные мессенджеры 16151 Ф~«Ы~~~~~Гй~:,'-"АМ~~~"-Ф 433 СР ч 14-3-3 (фосфосери- новый домен) белка экспрессируются в клетке, ВГР (лонор; возбуждение при 380 пль непускание при 460 нм) и ОГР (акцсптор; возбуждение при 475 им, непускание прн 545 нм) в неактивной РКА (тетрамер КзС«) достаточно близки, чтобы использовать РВЕТ.
Везде, гдс в клетке увеличивается содержание сАМР комплекс К,С, диссоциируст на Кз и 2С, н сигнал ГКЕТ пропадает, поскольку донор и акцептор теперь слишком удалены лруг от друга. При наблюдении с помощьк> бьтуорссцснтного микроскопа в области с более высокой концентрацией сАМР обнаруживается минимальный сигнал СГР и больший спгнат ВГР Измерение отношения испускания при 460 нм и 545 пм позволяет точно измерить изменение копцеитрапин сАМР Определяя это отношение для всех областей клетки, исследователь может созлать искусственное вспомогательное цветное изображение к|езки, гле относительная концентрация сАМР выражается интенсивностью паста. Изображении, регистрируемые через определенныс врсмснныс интервалы, дают картину изменений содержания сАМР во времени.
Вариант этой технологии использовали для измерения активности РКА в живой клетке (рис. 7). Исследователи создали мишень для РКА, синтезирован гибридный белок, солержащий четыре элемента: УГР (акцептор); короткий псптид с оста~ком 5сг, окружснныи консенсусной последонательностьк~ ддя РКА; СР)-5ег-связывающий домен (называемый 14-3-3); и СГР (донор). Когда остаток 5сг нс фосфорилирован, домен 14-3-3 не обладает сродством к нему, и гибрил- другие ферменты тоже регулируются ионами Саз' при помощи кальмодулнна (табл.
12-5). Активность Саз' как вторичного мессенлжера, подобно активности сАМР, можно ограничить на какой-либо территории; после того как его высвобождение вызвало локальный ответ, Саз' обычно удаляется, прежде чем диффундирует в отдаленные части клетки. Очень часто концентрация Са' не просто увеличивается и потом уменьшается, а, скорее, колеблется с периодом в несколько секунд (рнс. 12-12), даже когда концентрация гормона снаружи клетки остается постоянной. Механизм, лежащий в основе колебания концентрации ионов кальция, по-видимому, связан с регуляцией по типу обратной связи либо 433 527 нм ч з РВЕТ н ' РКА-согласованная последовательность АТР АОР РКА Рис.
7. Измерение активности РКА методом РклТ. Созданный с помощью генной инженерии белок связывает ТРР и СРР через пептид, содержащий остаток 5ег, рядом с которым находятся консенсусная последовательность для фосфорилирования РКА и фосфосеринсвязывающий домен 14-3-3. Активная РКА фосфорилирует остаток 5ег, который состыковывается с 14-3-3-связывающим доменом, что приводит флуоресцирующие белки в достаточную близость для возникновения РКЕТ, что указывает на присутствие активной РКА. ный белок существует в вытянутой форме, при этом донор и акцептор слишком улалены лруг от друга, чтобы генерировать сигнал ГКЕТ.
Повсюду, где в клетке активна РКЛ, она фосфорилпрует остаток 5сг в гибрплиом белке, н М-3-3 связывается с ОР-5ег. При этом оп соединяет вместе Ъ'ГР и СГР и сигнал ГКЕТ фиксируется с помощью флуоресцентного микроскопа, указывая на присутствие активной РКА. фосфолипазы, которая генерерирует 1Рз, либо ионного канала, который отвечает за высвобождение Саз' нз ЭР, либо и того. и другого. Каким бы ни был механизм, эффект заключается в том, что один вид сигнала (например, концентрация гормона) превращается в другой (частота и амплитуда колебаний внутриклеточно~о содержания Саз'). Другим возможным изменением являются локальныс «пятна», «облака» или «волны» ионов кальция — временное увеличение концентрации ионов Са', ограниченные определенным отделом клетки (рнс.
12-13). Сигнал Са' ослабевает по мере того, как ионы кальция диффунднруют от источника (кальцневого канала), удерживаются в ЭР или выкачиваются из клетки. Длинная цептральиаи спираль Ий (616) Часгь 1. 12. Биасигиаяизация а аДлиииаи центральная гпп~:. ~ь й а Ф ~,,Л,= Г-спираль Рис. 12-11. Каяьмодулин — белковый посредник дая многих фериентативных реакций, стимулируемых ионами Са". Каяьмодуаин содержит четыре вмсакоаффинных Са"-свяэывающих центра (Ке — 0,1 — 1 икМ). а) Ленточная модель кристаллической структуры кальиодуаина (РВВ 1В 1СП.). Четыре Са'-свяэывающих центра заняты ионами кальция (фиолетовый). Слева — К-концевой домен; справа — С-хонцевой домен. б) Кальмадулин, связанный са спиральным даменом (яраснмй цвет) одного иэ многих белков, которые он регулирует, — кальиадулинэависииой пратеинкинаэой 11 (РРВ 10 1СВ1).
Заметим, чта длинная центразьиая а- спираль, видимая на (а), изгибается назад при связывании со спиральным даменом субстрата. Центральная спираль, разумеется, в растворе более подвижна, чеи в кристалле. в) Каждый иэ четырех Са'-связывающих центров находится во фрагменте спираль-петля-спираль, называемом «ЕЕ-рухойж который присутствует также во многих других Са"-свяэывающих белках. Сигнальные системы с участием Саэ' и сЛМР связаны между собой. В некоторых тканях ионы кальция стилгулируют как аденилатциклазу, производящую сАМ Р, так и фосфодиэстеразу, разрушающуюсАМР Следовательно, временные и локальные изменения концентрации ионов кальция могут приводить к врелгенным и локальным изменениям концентрации сАМР. Мы уже упоминали, что сАМР-зависимый фермент РКА часто входит в состав строго локализованного надмолекулярного комплекса, образующегося вокруг каркасных белков, таких как АКАР. Внутриклеточная локализация ферментов-мишеней в сочетании с временным и пространственным градиентамн концентрации Сзэ' и сЛМР позволяет клетке отвечать на один или несколько сигналов соответствующими метаболичсскими изменениями, локализованными во времени и в пространстве.
Краткое содержание раздела 12.2 РЕЦЕПТОРЫ, СОПРЯЖЕННЫЕ С Б-БЕЛКОМ, И ВТОРИЧНЫЕ МЕССЕНД)КЕРЫ ° Сопряженные с С-белком рецепторы (СРСК) действуют через гетеротрнмерные С-белки. При связывании лнганда эти рецепторы катализнруют обмен СТР на СОР связанный с ассоциированным С-белком, вызывая отделение и-субъедини цы С-белка. Эта субъсднница стимулирует или ингибирует целевой фермент, изменяя концентрацию продукта его деятельности — вторичного мессенджсра. Са"-АТРаза плазматической мембраны (Сам-насос) Сам-высвобождающий канал саркоплазматического ретикулума Сам-зависимый Ха'-канал (у Рапаивспаа) Сам/кальмодулинзавнсимые протеннкнназы (СаМ-киназы с 1 по Ю) сАМР-регулируемый обонятельный канал сАМР-фосфоднэстераза сСМР-регулируемые Ха«ч Сам-каналы (клетки палочек и колбочек) ХА11'-киназа ХО-синтаэа (синтаза оксида азота) Аденилатцнклаза (в головном мозге) Глутаматдекарбокс плаза Кальцинейрин (фосфопратеинфосфатаза 2В) Киназы легкой цепи миозина РПКицчпгиаэа (рба) Фосфоиноэитид-3-кинаэа 12.2 Рецепторы„сопряженные с б-белком, и вторичные мессеиджеры (6! "!) !00 о б ию зоо зоо Время (г) 400 1,0 ОЛ 1Саю ! Спи> Рис.
12-12. Запуск колебаний внутриклеточной концентрации Са' виеклеточиыми сигналами. 0) Красителю (фура), флуоресценция которого меняется при связывании с Са', давали возможность диффундировать в клетки, и тут же измеряли интенсивность флуоресценции методом флуоресцентной микроскопии. Интенсивность флуоресценции показана цветом; концентрацию Са" можно оценить по цветовой шкале. В данном случае тимоциты (клетки тимуса — вилочковой железы) стимулировали зкзогенным АТР, который повышает в них внутреннюю концентрацию Са". По своим ответам клетки гетерогенны; некоторые имеют высокую внутриклеточную концентрацию Са" (красный цвет), другие — гораздо более низкую (голубой цвет).
б) Когда такой зонд используется для измерения содержания Са' в отдельном гепатоците, мы наблюдаем, что агонист норадреналин (время добавления показано стрелкой) вызывает колебания концентрации Са" от 200 до 500 нм. Подобные колебания индуцируются в других типах клеток другими внеклеточными сигналами. ° (з-А>!рсмс>рги ческий рецептор активирует с тимулирующий С-белок С„таким образом активируя цаеиилатциьзчазу и повышая концентрацию вторичиоп> месссилжера сЛМР 11иклический АМР стимулирует сАМР-зависиму>о и)х>теиикипазу, она в свою очередь фосфорилцруст клк>чевые белки, изменяя их активность. ° Фсрмситативиыс каскады, в которых одна молекула гормона активирует катализатор, кспс>рый в с.вок> очередь активирует Лруп>й катализатор и так далее, приводит к огромному усилепи>о сип>ала; это является характерной чертой болыпииства систем, активирусмых гормонами.
° Циклический ЛМР в копсчиом итоге уиичтожастся фосфолиэстеразой сЛМР а С, сам сеоя Выключает пузом Гидр!>!сиза связанного СТР ло СТ)Р действуя как ограничивающий с'ебя бинарный выклк>чатель. х аоо с с 4ОО с И зоо Ю .с 200 с> ° Еслисигналадреиалииадлитсльиый,сис'пифичпая к (3-адрепергпческоыу рецептору протсиикииаза и 1>-аррс>стим временно дссенсибилизируюг рецептор и заставлякл сто переместиться во впутриклеточпые везикулы. ° 11скоторые рецспторы стимулируют алсиилатпиклазу посредствам С,; другие ипгибируют сс посредством ()с Чаким образол>, клеточная конце>прация сАМР является с>басим ответом иа действие двух (или оолсс) сигналов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
