Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 122
Текст из файла (страница 122)
Олигосахариды несут в себе гораздо больше информации, чем молекулы нуклеиновых кислот или белков. ° Лектины — белки со специфическими углевод-связывающими участками — обычно располагаются на внешней поверхности клетки, где инициируют взаимодействия с другими клетками. Лектины позвоночных по оли- госахаридным лярлыкам» узнают некоторые пептидные гормоны, циркулирующие белки плазмы и клетки крови и регулируют их уничтожение. ° Прикрепление патогенных вирусов, бактерий и некоторых эукариотических паразитов к клеткам организма-хозяина происходит через связывание лектинов на клетках патогенов с олигосахаридами па поверхности клеток хозяина. ° Внутриклеточпыс лектицы участвуют в доставке внутриклеточных белков к определенным органеллам или к месту их секреции.
° Рентгеноструктурпый анализ позволил детально изучить комплексы лектинов с сахарами и установить комплементарность этих молекул, объясняющую прочность и специфичность их взаимодействий. 7.5. Методы анализа углеводов Растущее понимание важной роли олигосахаридов в процессах биологического узнавания подтолкнуло развитие методов анализа структуры и стереохимии сложных олигосахаридов.
Анализ олигосахаридов затрудняется тем, что в отличие от пептидов и нуклеиновых кислот они могут разветвляться и соединяться при помощи разных типов связей. Высокая плотность зарядов многих полисахаридов и олигосахаридов и относительная лабильность сульфатпых эфиров в гликозаминогликапах только усугубляют эти трудности. Для простых линейных полимеров, таких как амилоза, положение гликозидпых связей определяют путем обработки исходного полисахарида метилиодидом в сильношелочной среде, в результате чего все свободные гидроксильные группы метилируются и становятся кислотоустойчивыми, а затем метилированный полисахарид гидролизуют в кислоте.
Свободные гидроксильные группы в полученных таким образом производных моносахаридов — это те, что участвовали в образовании гликозидных связей в исходном полимере. Для определения последовательности моносахаридных звеньев и имеющихся разветвлений используют ферменты экзогликозидазы с известной специфичностью: они по очереди отзцепляют моносахаридпые остатки от невосстапавливающего конца цепи. Специфичность этих экзогликозидаэ часто позволяет определить положение и стсреохимию каждой связи. Для анализа структуры олигосахаридцой части гликопротеипов и гликолипидов олигосахаридпую часть отщепляют с помощью очищенных ферментов.
Гликозидазы специфическим образом расщепляют О- или М-олигосахарилные связи, а липазы удаляют «головки» липидов. Кроме того, свяэанныс О-гликозидпой связью гликаны можно вылелить из гликопротеинов, обработав гидразином. Разделитьполучецную смесь сахаров на отдельные компоненты можно разными способами (рис. 7-3б), включая те, что применяются для разделения белков и аминокислот: дробное осаждение растворителями и ионообменная и зксклюзиоппая хроматография (см.
рис. 3-17). Очищенные лектины„прикрепленные к твердому носителю, часто применяются в аффннной хроматографии для разделения смесей сахаров (см. рис. 3-17, о). При гидролизе олигосахаридов и полисахаридов под действием сильных кислот образуется смесь моцосахаридов, которые люжно идентифицировать с помощью хроматографических методов; таким образом можно установить общий состав полимера. 13801 Часть 1. 7. Углеводы и гликобиология Отделение олигасахарилов с помощью зидогликозидаз . с)медь ,гьктгттсзязрйдей 1) Ипггообмеггнаа хроматография ,' 2) Гель-фильтрация ~ 3) Аффиииал хроматография с применением лекгицов Ралджгсивые олпггаик )гиды. О ппцевпый позцсакзрил ! Полное ~ метилироваиие ~ (СНз1) в сильвой 1 щелочи Полностью метилировациый углевод ~ Гидролиз сильной , 'кислотой Моиосахариды Разделение фрагментов Кислотный гидрслиз приводит к образованию смеси моцосахаридсв, метитилировапиых пс всем — ОН-группам, кроме участвовавших в гликозидных связях ВЭЖХ или превращение в лстучис производные и гээожидкпстпаэ хроматография Мстилироаапие или фермептативцый анализ каждого олигосахарида Последовательность моиосахаридов; положение и конфигурация гликозидиых сввэей Последовательность моиосахаридов; коложеиие и конфигурации гликозидиых связей Состав смеси Типы и количества моиосахаридиых единиц Положение гликоаидимх связей Рис.
7-36. Методы анализа углеводов. Для полной характеристики очищенного ка первом этапе углевода иногда приходится применить все четыре аналитических подхода. Анализ олигосахарилов все в большей степени осуществляется с помощью методов масс-спектрометрии н ЯМР-спектрометрии высокого разрешения. Для анализа таких полярных соединений, какими являются олигосахариды, можно использовать методы масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбционной ионизацней (МАЕЕ)1) и тандемной масс-спектрометрнн (доп. 3-2).
Метод МАЕР! настолько чувствителен, что позволяет определять массу ионов (в данном случае целых олигосахарндных цепей; рис. 7-37). Методом тандемной масс-спсктрометрии опреле- 1 Фермеитативный ЯМР и , 'гидролиз специфическими масс-спектро- ~ гликсзидазами ~ метрия о р меньшего размера лают как массу ионов, так н их фрагментов, возникающих в результате разрыва гликозилных связей. Данные ЯМР (доп. 4-5) помогают определить последовательность моносахарнлов, положения связи и конфигурацию аномерных атомов, особенно если дело касается олнгосахаридов среднего размера.
Например, структура участка гепарнпа, пространственная модель которой представлена на рнс. 7-22, полностью была установлена по данным ЯМР- спектроскопии. Для рутинного определения структуры алигосахаридов используют автоматизированные методы и специальные при- 75 Методы анализа углеводов (ЗВ!1 Краткое содержание раздела 7.5 МЕТОДЫ АНАЛИЗА УГЛЕВОДОВ Рис. 7-37. Разделение и количественный анализ олигосахаридов иэ смеси гликопротеинов. В данном эксперименте смесь белков, выделенных из почечной ткани, обрабатывали таким образом, чтобы отделить олигосахаридные цепи, которые затем анализировали иетодом масс-спектрометрии (МАПП-М5).
Каждому олигосахариду соответствует пик с определенной молекулярной массой, а площадь пика отражает количество этого олигосахарида в образце. Самый крупный пик соответствует олигосахариду с массой 2837гь который состоит из 14 остатков. В том же образце обнаружены олигосахариды, содержащие 7 и 19 остатков. боры, однако определение последовательности разветвленного олигосахарида с несколькими типами связей остается гораздо более сложной задачей, чем определение линейной послеловательности белка или нуклеиновой кислоты. Важная роль при анализе сахаров отводится химическому синтезу.
Этот метод широко используется для изучения биологических функций гликозаминогликанов н олигосахарндов. Химия подобных процессов сложна, но современные методы позволяют синтезировать короткие фрагменты практически любого гликозаминогликана с треГ>уемой стереохимической структурой, ллнной и расположением сульфатных групп, причем синтезнруемые олигосахариды могут иметь горазло более сложнун> структуру, чем те, что изображены на рис. 7-29. Твердофазный синтез олигосахарилов основан на тех жс принципах, что и синтез пептидов, и имеет те же преимушества (см.
рис. 3-29). Однако в химии углеволов ъюгут применяться особые приемы: защитные группы и активируклцие группы должны обеспечивать синтез глнкозидной связи с правильным расположе- нием гидроксильных групп. Очищенные ферменты гликознлтрансферазы очень полезны для синтеза чистых химических соединений.
Г(одобныс сннтетические методы представляк>т сегодня большой интерес, поскольку выделить из природного источника и получить в чистом виде определенный олнгосахарид достаточно сложно. Для определения специфичности связывания можно использовать олигосахаридные микрочины и лектицы с флуоресцентной меткой (аналогично тому, как это описано в гл. 9 для ДИК-микрочипов). ° Для полного установления структуры олигосахарида или полисахарида необходимо определить места разветвлений, последовательность моносахаридов в каждой ветви, конфигурацию каждого моносахаридного звена, а также положения гликозилных связей; эта аадача но сложности намного превосходит [382] Часть 1.
7. Углеводы и гликобиологил анализ последовательности б>елка или нукле- иновой кислоты. ° Структуру олигосахаридов и полисахаридов обычно определяют, применяя комбинацию нескольких методов: специфический ферментативный гидролиз помогает определить стереохимию соединения и получить более мелкие фрагменты для анализа; метилированне и кислотный гидролиз позволяют локализовать гликозидные связи; последовательное расщепление дает информацию о последовательности моносахаридов и конфи>урации аномерных атомов углерода.
° Масс-спектромстрия и ЯМР-спектрометрия высокого разрешения позволяют из небольшого количества образца извлечь большой объем информации о последовательности звеньев, конфигурации аномерных и других атомов углерода, а также положения гликозидных связей. ° Методы твердофазного синтеза позволяют получать олигосахариды заданной структуры, что очень важно для изучения взаимодействий олигосахаридов с лектипами и, кроме того, может иметь важное клиническое значенис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
