Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Разработка методов клонирования и секвепироваппи (определения последовательности мономеров) ДНК произвела подлинную революцию в изучении нуклеиновых кислот и вообще в биологии. 2. Определение структуры бпомолекул. После очистки биомолекул можно определить их структуру. Это — совершенно необходимое условие успешного детального изучения корреляции между структурой и функцией. Основные методы, используемые для анализа структуры биомолекул, перечислены в табл. 2.6.
Они должны быть знакомы читателям, Биооолимеры и биохимические методы 17 Таблица 2.6. Основные методы определения структуры био- молекул Элементный анализ Спектроскопии в Уф-, видимой и инфракрасной областях, ЯМР-спектроскопия Использование кислотного или щелочного гядролвза для расщепления изучаемых молекул на составляющие компоненты Использование набора ферментов с известной специфичностью для расщепления изучаемых молекул (например, использование протеаз, нуклеаз, гликозидаз) Масс-спектрометрия Специфические методы секвенирования (напрямер, белков или нуклеиновых кислот) Рентгеновская кристаллография изучавшим органическую химию. Специфичность действия ряда ферментов позволяет использовать их в качестве мощных инструментов для выяснения структурных особенностей некоторых биомолекул.
Теоретический и технический прогресс, позволивший повысить разрешающую способность массспектрометрии и ЯМР-спектроскопии, способствовал тому, что эти методы стали широко использоваться для определения структуры молекул. Например, крайне сложную структуру углеводных цепей, входящих в состав некоторых биомолекул, в частности Таблица 2.7. Иерархическая последовательность препарато Метоя Комментарии Использование гомогената Исследования на уровне целого организ- ма Исследование изолированного перфузируемого органа Использование ткаиевых срезов Использование целых клеток Исследование изолированных клеточных органелл Субфракционирование органелл Выделение и характеристика метаболитов и ферментов Клонирование генов, кодирующих ферменты и другие белки гликопротеинов, во многих случаях удалось установить с помощью ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.
Наиболее детальную информацию о структуре биомолекул дают методы рентгеновской кристаллографии. Именно благодаря их использованию была установлена детальная структура различных белков и ферментов, а также открыта двойная спираль ДНК. 3. Изучение функций и метаболизма биомолекул с использованием различных препаратов. Первые биохимические исследования человека и животных проводились на уровне целого организма. В качестве примера можно привести изучение дыхания и судьбы поступающих в организм соединений.
Вскоре стало ясно, однако, что целый организм слишком сложен, чтобы можно было получить четкие ответы на различные вопросы. Многие проблемы, возникавшие при работе на целом организме, были устранены после приготовления более простых препаратов и изучения их ш ч(1го. В табл. 2.7 приведены различные типы препаратов, которые используются в настоящее время для изучения биохимических процессов; большинство сведений, содержащихся в этой книге, получено именно на таких препаратах. В таблице препараты перечислены в порядке уменьшения нх сложности. Однако использование более простых препаратов тоже имеет свои ограничения. Резув, исполъзуемъ1х для изучения биохимических процессов Они могут включать 1) удаление органа (например, гепатэктомия) 2) изменение диеты (голодание — усиленное питание) 3) прием лекарств (например, фенобарбитала) 4) введение токсических веществ (напрнмер, четыреххлористого углерода) 5) наблюдение за животным со специфическими заболеваниями (нацример, сахарным диабетом) 6) использование сложных методов, таких, как ЯМР-спектроскопии и позитронно-эмиссионная томография Наиболее пригодны сердце, печень, почки Особенно срезы печени 1.
Особенно это относится к клеткам крови, которые относительно легко поддаются выделению 2. Клетки в культурах тканей являются незаменимым объектом во многих областях биологии 1. Позволяет работать с бесклеточными препаратами 2. Можно добавлять или удалять (путем диализа) различные соединения и наблюдать за последствиями 3. Путем центрифугирования можно провести дальнейшее субфракцяанврование, что позволяет получить индивидуальные клеточные органеллы Широко используется для изучения функций митохондрий, эндоплазматического ретикулума, рибосом и т.д. Широко используется, например, при изучении функций митохондрий Важнейшая часть анализа любой химической реакции или метаболвческого пути Выделение клонированного гена необходимо для изучения деталей его структуры я регуляции; позволяет установить аминокислотную последовательность белка, который им кодируется глава 2 Дополнительные замечании по препаратнвной работе и стратегии исследовании льтаты экспериментов ш чгго могут оказаться оши- бочными, например в том случае, когда при гомоге- низации клеток высвобождаются ферменты, частич- но разрушающие исследуемые соединения.
Рис. 2З. Стратегия изучения метаболического процесса илн метаболичсского пути. Используемая процедура не обязательно должна включать все перечисленные здесь этапы. Однако применение именно этих подходов позволяет обычно выяснить детали биохимических процессов или метаболических путей. Эта схема в обгцсм виде использовалась для изучения главных метаболических путей, рассматриваемых в послсдуюшнх главах. Полезно сделать еще несколько замечаний по некоторым позициям, указанным в табл. 2.7 н на рис. 2.3. 1. Возможность артефактов нисколько. не снимает абсолютной необходимости выделения и идентификации каждого компонента, участвующего в биохимическом процессе, в чистом виде; без этого В этой книге основное внимание уделено ело- невозможно понять, как протекает процесс на молежным биохимическим процессам (например, синтезу кулярном уровне.
Подтверждением этому могут белков,мышечномусокращению),втомчислеи раз- служить многочисленные примеры, которые нам личным метаболическим путям. Метаболичеекий встретятся в дальнейшем. 2. Важно научиться рекоипуть — это совокупность реакций, ответственных за струировать процесс ш уйго путем систематического аиггез сложных соединений из более простых и за ра- подбора индивидуальных компонентов. Если после спад соединения до конечных продуктов. Тот или сборки всех компонентов системы процесс все-таки иной сложный биохимический процесс или метабо- не идет, это может означать отсутствие какого-то валический путь иногда проявляется на уровне целого жного компонента, который был пропущен при организма.
Примером такого рода может служить идентификации и не добавлялся при сборке. 3. Бласокращение мышц. Мы знаем,что глюкоза является годаря достигнутым в последние годы успехам источником энергии для человека и других живот- в области технологии (например, в ЯМР- ных, а это означает, что в организме человека она спектроскопии и позитронно-эмиссионной томоградолжна распадаться (подвергаться метаболизму) фии) появилась возможность выявлять определенс выделением энергии.
Однако для того„чтобы полу- ные биомолекулы на уровне обследования целых орчить полное представление о том, каким образом ганов н следить за изменением их содержания во врепроисходит метаболизм глюкозы в клетке — а мы мени. Этопозволяетанализироватьмногиесложные такого представления (в частности, о механизме ре- биохимические процессы ш чиччо. 4.
Лишь после того, гуляции) пока не имеем,— необходимо провести ис- как наблюдения, выполненные на разных уровнях, следования на других уровнях. На'рис. 23 представ- дадут согласующиеся между собой результаты, молены различные типы наблюдений и анализа„кото- жно с уверенностью говорить о реальных успехах рые позволяют полностью охватить весь биохими- в понимании изучаемого биохимического процесса. ческий процесс, такой, например, как распад глюко- Если же при использовании разных подходов вознизы и высвобождение энергии (этот процесс известен кнут существенные расхождения, следует искать прикакгликолиз).
Эта схема в общих чертах применима чину этих расхождений до тех пор, пока не будет ко всем основным биохимическим процессам, обсу- найдено рациональное объяснение. 5. Описанное выждаемым в этой книге, и, таким образом, иллюстри- ше сочетание разных уровней исследования и разнорует общую стратегию изучения биохимических про- го рода препаратов может использоваться для выявцессов; об этом следует помнить, рассматривая лю- ления биохимических изменений у животных, бой биохимический процесс (глнколиз, окисление связанных с изменениями метаболизма (например, жирных кислот и т.д.).
при ограниченном или усиленном питании) или Вывод о сушествованин биохимического процесса илн метаболнческого пути, сделанный на основании наблюдений над целым организмом Анализ механизмов, контролируюших процесс 1п кто Анализ нарушений процесса, вызванных специфическими болезнямн (врожденные ошибки метаболизма, рак и т.д.). $ Локализация процесса в одном илн нескольких органах . Локализация процесса в одной илн нескольких клеточных органеллах нлн субклеточных фракциях г Рассмотрение процесса в виде отлельных реакций Очистка его индивидуальных субстратов, продуктов, ферментов, кофакторов н других компонентов $ Анализ механизмов, контролирующих процесс ш тяго 4 Изучение механизмов отдельных реакций 4 Реконструкция процесса Изучение процесс» на генетическом уровне методом рекомбинантных ДИК Биополимеры и биег<ииичеекие мегисг<гаг 19 Сг абпльные изотопы Радиоактивные изотопы 21З 15)Ч 1ао 2Н 14С ггР 35$ "Са 1251 1311 с определенными заболеваниями (сахарный диабет, рак).
б. Большая часть описанных выше методов и подходов применима для изучения клеток или тканей человека в норме и патологии. При этом необходимо тщательно следить за тем, чтобы использовались только свежеприготовленные препараты, а кроме того, следует обращать особое внимание на этические вопросы, связанные с проведением экспериментов на человеке. Использование изотопов в биохимии Очень большую роль сыграло введение в биохимическую практику изотопов в 1930-х гг. Ранее было очень трудно пометить биомолекулы, чтобы затем следить за их превращениями в ходе метаболизма. В пионерских исследованиях, прежде всего Шонхеймера и его коллег, для решения многих биохимических задач использовались стабильные изотопы (2):), 15Щ за судьбой которых далее следили с помощью масс-спектрометрии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
