Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных — в органических растворителях. Отметим, что в ряду неполярных аминокислот (О1у, А1а, Ча1, 1 ец) при увеличении длины неполярной боковой цепи, сопровождающемся усилением ее неполярного характера, увеличивается и подвижность аминокислоты. Отношение расстояния, на которое перемешается данная аминокислота, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя (оба они отсчитываются от точки нанесения смеси аминокислот), обозначают через Р„(подвижность по отношению к фронту растворителя).
Значение Рг для данной аминокислоты зависит от условий эксперимента, например от типа растворителя. Хотя предварительную идентификацию аминокислоты можно провести исходя лишь из ее значения Яп рекомендуется одновременно с не- Рис. 3.Ю. Идентификация аминокислот, входящих в состав белков.
После хроматографического разделения на бумаге с использованием в качестве растворителя системы буганол/уксусная кислота (нисходящий вариант) аминокислоты окрашивают нингидрином. известной смесью проводить хроматографирование известной стандартной смеси аминокислот. В этом случае подвижность исследуемой аминокислоты можно отнести к подвижности стандарта (например, не Я„а Я„ь). Подвижности, выраженные относительно стандарта, меняются от эксперимента к эксперименту в меньшей степени, чем Яг.
Для количественного анализа аминокислот каждое пятно вырезают и злюируют (вымывают) вещество подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в проходящем или отраженном свете. При двумерной хроматографии иа бумаге образец наносят на один из углов квадратного листа бумаги и проводят разделение в одной системе растворителей. Затем лист вынимают, высушивают, поворачивают его на 90" и хроматографируют в другом растворителе (рис. 3.11). Топкослойная хроматография Имеются два четко различающихся варианта тонкослойной хроматографии.
Распределительная тонкослойная хроматография (РТСХ) сходна с рас- Аминокислоты собностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной илн более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте, например на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липнды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. иупаюв/уксусмав кислота/вова 1в:1.9 Автоматическая иоиообмеиная хроматография Разделение аминокислот можно проводить разными методами, но для анализа аминокислотного состава полипептида после его гидролиза обычно используют автоматическую иоиообменную хроматографииь Полное разделение аминокислот, их идентификация и количественная оценка занимают менее трех часов. В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в )Ча'-форме.
Когда кислотный гидролизат при рН 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с Ха+. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях рН и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную— двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком (рис.
3.12). Рве. ЗЛ1. Двумерная хроматограмма аминокислот, входящих. в состав белка (воспроизведена с некоторыми модификациями из работы Апа!. СИИ. 1953:25:396). пределительной хроматографией на бумаге, а адсорбционная тонкослойная хроматография (АТСХ) основана на совершенно иных принципах. При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или на других сравнительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей н такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге. Возможна и РТСХ с обращенной фазой.
Разделение с помощью АТСХ определяется спо- й 1 и З к в в * 70 н Н 3,2 РН 1.25 бб вС Рис. 3.12. Автоматический анализ кислотного гидролизата эндосперма пшеницы по Муру н Штейну на колонках даузкс- 50 (при 55 С). 4. Для идентификации осн6вных аминокислот используется короткая колонка (5 х 0,9 см); элюирование проводят прн рН 5,28, продолжительность опыта 60 мин.
Б. Для разделения нейтральных и кислых аминокислот используется более длинная колонка (55 х 0,9 см); элюироваиие проводят сначала буфером с рН 3,25, а затем буфером с рН 4,25. В качестве внутреннего стандарта добавлей норлейцин. Оснбвные аминокислоты остаются на колонке. Продолжительность. опыта 180 мин. Элюнруемые фракции автоматически обрабатывают нннгидрнном, после чего измеряют их оптическую плотность при 570 и 440 нм. Регистрация при длине волны 440 нм используется исключительно для идентификации пролииа и гидроксипролина (в эндосперме пшеницы они отсутствуют). (С любезного разрешения Е.Т.
Мсг1к, Ражие 13п1- уеги1у.) 32 Г.инса 3 Высоковольтный электрофореэ иа ииертпых носителях В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. При разделении аминокислот в качестве инертнъгх носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5 — 2 ч при напряжении 2000 — 5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс.
Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот„ низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов и сахарофосфатов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения.
В электрическом поле молекулы, несущие при данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд,— к катоду, Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в Уф-свете (при работе с нуклеотидами). Выбор рН определяется значениями рК диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. Прн рН 6,4 глутамат и аспартат несут заряд — 1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения.
При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение. ЛИТЕРАТУРА Ваптп б. С. СЬсппвггу апд В1осЬсгп1вггу оГ йс Апппо Асов, СЬаргпап апд НаП, 1985. Соорег Т.б. ТЬе Тоо1в оГ В1осЬсгп1вггу, 7Иеу, 1977. Ег1ейиаи М. ТЬе СЬеппзггу апд В1осЬеппвггу оГйс БиИЬуйгу1 Огоир 1п Агп1по Аси)в, Рер6дев, апд Ргогс1пв, Рсгязгпоп Ргевв, 1973. бгезпвгейг Х Р.. и'иигг М. СЬеппс1гу оГ йе Апппо Ас1г1в, 3 зо1в, %11еу, 1961. НеГ1гпап Е. СЬгогпа1о8гарЬу: А ЕаЬога1огу Нзпг)Ьоо1г оГ СЬгогпагоягарЫс апд Е1есггорЬогейс МегЬодв, Зп1 сд., Уап Ховггапд, 1975.
Таис11згопе Х С. Ргасйсе оГ ТЬ1п 1ауег СЬгогпаго8гарЬу, %1- 1еу-!п1егвс1епсе, 1978. Уюегя б.. Якша Х НапдЬоо1с оГ СЬгогпаго8гарЬу, 2 мо1в, СКС Ргевв, 1972. Глава 4 Пептиды Вимтпор Родуэлл ВВЕДЕНИЕ Когда карбоксильная и аминогруппа аминокислот соединяются, образуя пептидную связь, соответствующие аминокислоты превращаются в аминокислотные остатки.
Пептид состоит из двух или более аминокисдотных остатков, связанных пептидными евязямн. Пептиды из более чем 10 аминокислотных остатков называются полипептидами. БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Пептиды имеют очень большое биомедицинское значение; особенно велика их роль в эндокринологии. Пептидами являются многие важнейшие гормоны человека. Их часто назначают больным для коррекции соответствующей недостаточности. Самый известный пример — введение инсулина больным сахарным диабетом. Пептидами являются также различные антибиотики (валиномицин, грамицидин А) и некоторые противоопухолевые препараты (например, блеомицин). Разработанные в последние годы методы быстрого химического синтеза пептидов позволили наладить производство пептидных гормонов в значительных количествах; это разрешило многие проблемы, поскольку обычно гормоны присутствуют в организме животных в очень малых концентрациях и нх трудно выделить в количествах, достаточных для терапевтических целей.
По той же технологии осуществляется синтез и других пептидов, которые ввиду их малого содержания тоже трудно вьщелять из природных источников„в частности, зто относится к вирусным пептидам, используемым в качестве вакцин. СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ Общие сведения о структуре пептида На рис. 4.1 изображен трипептид, состоящий из аминокислотных остатков аланина, цистеина и валина. Отметим, что трипептнд содержит тря остатка, но не три нептидные связи. Структуру пептнда принято Апенин циствинии Валин Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
