Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Для проявления используют кумасси синий или Ая+ (полипептиды), бромистый этидий (полинуклеотиды) и т.д. Весьма распространено использование электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Белок прогревают и затем проводят электрофорез в присутствии денатурирующих агентов — моче- вины или додецилсульфата натрия (ДСН), чтобы создать условия, благоприятные для разделения молекул по размеру. Электрофорез в ПАГ-ДСН широко используется для определения молекулярной массы белковых субъединиц; метод основан на сравнении их подвижности с подвижностью стандартных препаратов известной молекулярной массы. облесть А я с о а з,о Облесть в Облесть Б я Ю сь с уо 60 о БО й тч О,Б зо 20 о ~о 20 ЗО 40 Време, млм о 2оо во Боо аоо Объем, гчлллмеллй через гель.
мл Рис, 4.7. Гель-фильтрация бромциановых (СВ) фрагментов фетального глобина человека. Хроматография проведена на колонке сефадекс О-50, уравновешенной 1%-ным НСООН, с последующей злюцней тем зке раствором. Нумерация фрагментов а- и у-цепей произвольна. (С любезного разрешения 3.
В. Реагзоп е~ а1., Г)ерагцпеп~ оГ Вюспепи'- мгу, Ригби $)п(тегяну.) гидролиз в 6 н. НС1 при 110'С в вакуумированной ампуле. В этих условиях полностью разрушаются триптофан к цистеин и частично цистин. В присутствии металлов наблюдается частичная потеря метионнна и тирозина. Глутамин и аспарагин количественно дезамндируются в глутамат и аспартат. Содержание серина и треонина тоже оказывается заниженным, причем в тем большей степени, чем дольше проводится гидролиз. Наконец, некоторые счязи между нейтральными остатками (Уа1-Уа1, Ие-йе, Уа1- 11е, Ие-Уа1) даже через 20 ч гидролизуются лишь на 50%. Обычно параллельные пробы гидролизуют в течение 24, 48, 72 и 96 ч.
Затем данные по сернну и треонину наносят на график в полулогарифмическом масштабе и проводят экстраполяцию к нулевому моменту времени, По валину и изолейцину используют результаты, полученные при 96-часовом гидролизе. Дикарбоновые кислоты и их амиды определяются суммарно и регистрируются как "С1х" или "Аях". Цистеин и цистнн до гидролиза превращают Рис.
4.8. Жидкостная хроматография с обращенной фазой при высоком давлении: профиль злюирования бромциановых (СВ) фрагментов фетального глобина человека. Нумерация фрагментов а- и у-цепей произвольна. (С любезного разрешения 3. О. Реагяоп с1 а1., Верагппепг оГ В1оспеппягу, Рагс)ае ()пгяегвйу.) в кислотостабильные производные (например, в цистеиновую кислоту). Для анализа триптофана проводят щелочной гидролиз; при этом происходят разрушение серина, треонина„аргинина и цистеина и рацемизация всех аминокислот. По окончании гидролиза аминокислотный состав можно определить с помощью автоматической иоиообмеииой хроматографии (см. рис.
3.12) или жидкостной хроматографии под давлением. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ПОЛИ ПЕПТИДОВ Уже более трех десятилетий минуло с тех пор, как Сенгер поразил биохимический мир, установив с помощью химических и ферментативных методов полную первичную структуру гормона инсулина. Подход Сентера состоял в следующем. Сначала он разделил две полипептидные цепи инсулина, А и В, и далее провел их специфическое ферментативное расще- зв пление на небольшие пептиды, содержащие перекрываюшиеся участки последовательности.
Он разделил эти пептиды и, используя реагент 1- фтор-2,4-динитробензол (рис. 4.9), идентифицировал их Х-концевые остатки. Кроме того, он определил аминокислотный состав пептидов и в итоге смог установить их структуру. Сравнивая последовательности перекрывающихся пептидов, он однозначно установил первичную структуру обеих цепей, А и В. В общих чертах стратегия Сенгера сохранила свое значение и до наших дней, однако за истекшие десятилетия были разработаны два новых подхода, которые произвели революцию в определении первичной структуры полипептидов (белков).
Первый подход основан на разработанной Эдманом в 19б7 г. автоматической процедуре последовательного отшепления и идентификации Х-концевых аминокислотных остатков в виде их фенилтиогидантоиновых производных. Второй подход связан с методом, разработанным Сенгером и, независимо, Максамом и Гилбертом, позволяющим проводить быстрое и однозначное секвенирование гена, кодируюшего рассматриваемый белок. Оптимальная стратегия состоит в одновременном использовании обоих подходов, Автоматическая деградация по Эдману, намного более быстрая по сравнению с первоначальным ручным методом Сенгера, тем не менее сильно уступает по скорости методам секвенирования ДНК и сопряжена с рядом трудностей.
С другой стороны, секвенирование ДНК не всегда дает однозначную первичную структуру исследуемого белка. Главным ыо, н н ! ! о,!ч ~ ~ р+ н -н-сн -соон нс но, н и ! ! О,Ы ~ ' 1Ч-СН-СООН Рис. 4.9. Реакция аминокислоты с 1-фтор- 2,4-дииитробензолом (реагеитом Сенгера). Реагеит назвав в честь нобелевского лауреата (1958 г.) биохимика Фредерика Сеигера. который использовал его для определения первичной структуры инсулина. Вначале арилируют (с количественным выходом) всех свободные аминогруппы, после гидролиза пап т ила образуются 2,4- ли иитрофеиил-про из води ые аминокислот, обладающие яркой желтой окраской. Количественный анализ этих проиэволиых осуществляют спехтрофотометрическими методами.
С дииитрофторбеизолом реагируют также г.-амииогруппа лизина, имидазольная группа гистидииа, ОН-группа тирозииа и БН-группа цистеииа. Динитрофеиильиые группы не отщепляются при кислотном гидролиэе и используются для идентификации )Ч-хоицевых аминокислот в полипептидах.
осложнением при секвенировании эукариотических генов является присутствие внутри гена иитронов (гл. ЗВ), которые не считываются в ходе экспрессии и не представлены в зрелом белке. В то же время большим преимушеством метода секвенирования ДНК является относительная легкость обнаружения и сек вени рова ния участков, присутствующих только в предшественнике белка и отшепляемых при его созревании. Таким образом, секвенирование ДНК и автоматическая процедура Эдмана дополняют друг друга; их совместное использование коренным образом изменило'и расширило наши знания о первичной структуре белков. Секвенирование ДНК мы рассмотрим в гл.
38, а процедуру Эдмана — в следующем разделе. АВТОМАТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТН ОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПОЛИПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ЭДМАНА Разделение н» линейные полипептиды Молекулы многих белков содержат более одной полипептидной цепи; эти цепи связаны либо нековалентными связями, либо дисульфидными мостиками. Поэтому первым шагом должно быть выделение индивидуальных полипептидных цепей. Диссоциацню нековалентно связанных полипептидов проводят с помошью денатурируюших агентов (мочевины, гуанидингидрохлорида), которые разрывают водородные связи. Днсульфидные мостики разрушают с помошью окисляюших и восстанавливающих агентов (рис.
4.10). Затем проводят хроматографическое разделение полипептидов. Расщепление полипептида нн фрагменты, пригодные для автоматического секвепировяния Приборы для автоматического секвенирования (секвенаторы) работают наиболее эффективно, когда длина полипептидов составляет 20 — 60 остатков. Эти требования в значительной мере способствовали разработке методов расшепления полипептидов на фрагменты нужного размера и нх очистки. Основной задачей стало не получение большого числа малых фрагментов, пригодных для ручного секвенирования, а расщепление на малое число крупных фрагментов (от 30 до 100 остатков). При этом желательно было осуществить полное высокоспецифичное расщепление по ограниченному числу связей.
Этим требованиям отвечает расщепление цианогенбромидом (С1ЧВг), трипсином и о-иодозобензолом. А. СХВг. Предварительно проводят модификацию остатков цистеина иодоуксусной кислотой. Далее с помощью СХВг специфически расшепляют связи на СООН-стороне от остатков метионина. нн о= Реагеит Здмана и реакция Эдмаиа но редкие связи типа Тгр-Х. Предварительной защиты других остатков при этом не требуется. Г. Гидроксиламиа. Гндроксиламин 'расщепляет сравнительно редко встречающиеся связи Авп-О1у, но выход не является количественным. Д. Протеаза из Б)арф!ососсиз аигеиз У8 расщепляет связи типа 61и-Х, преимущественно в тех случаях, когда Х вЂ” гидрофобный остаток.
Связь О1ц- 1.уа не расщепляется. Эта реакция полезна также для последующего расщепления СХВг-фрагментов. Е. Мягкий кислотный гидролиз. Расщеплению подвергаются редко встречающиеся связи Аар-Рго, Двух-трех наборов фрагментов, обычно получаемых при расщеплении исходного полипептида по остаткам Ме(, Тгр, Агй и по связям Аап-О1у, вместе с субфрагментами, полученными при дополнительном расщеплении, обычно оказывается достаточно для определения полной первичной структуры полипептида.
Если не возникает каких-либо непредвиденных трудностей в очистке фрагментов, то при должной тщательности для всей процедуры необходимо всего несколько микромолей полипептида. Фрагменты очищают с помощью гель- фильтрации в уксусной или муравьиной кислоте (рис. 4.7), с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой при высоком давлении (рис. 4.8) или ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе или на сульфофеннл-сефадексе. Рнс. 4ЛО. Две соседние подипептндные цепи соединены дисудьфидной связью (затенена). Расщепление этой связи путем окисления надмуравьиной кислотой (х.наа) иди путем восстановления (3-меркаптоэтанолом (кпрааа) приводит к образованию двух пептидов, содержащих остатки цнстсиновой кислоты или цистеина соответственно.
в большинстве случаев с количественным выходом. Остатки метионина в полипептидах встречаются достаточно редко, поэтому в результате такого расщепления образуются пептидные фрагменты желаемого размера. Б. Трипеии. Трипсин расщепляет связи на СООН- стороне от остатков лизина и аргинина. Чтобы ограничить число мест разрыва, остатки лизина предварительно модифицируют цитраконовым ангидридом (реакция носит обратимый характер); в результате положительный заряд остатков лизина заменяется на отрицательный. Модификация остатков аргинина менее целесообразна, поскольку остатки лизина встречаются относительно чаше. Однако она бывает полезна для дальнейшего расщепления СХВгфрагментов. В. о-Иодозобеизол. Этот реагент специфически и с количественным выходом расщепляет сравнитель- При автоматическом секвенировании вместо реагента Сенгера применяют фенилизотиоцианат (реагент Эдмана); в результате реакции происходит отщепление Х-концевого остатка в виде его фенилтиогидантоинового производного (реакция Эдмана; рис.
4.11). Все реакции протекают в пленке раствора, которая покрывает стенки вращающейся цилиндрической камеры. Это облегчает экстракцию и последующее удаление растворителей. Несколько фирм выпускают приборы, позволяющие проводить полностью автоматизированное определение последовательности полипептидов, содержащих до 30 — 40 остатков (в некоторых случаях до 60 или даже до 80 остатков) за один прогон. В прибор заложена программа последовательного отщепления по Эдману Х- концевых остатков полипептида. После отщепления, выделения и идентификации исходной М-концевой аминокислоты (рис. 4.11) образуется эдмановское производное следующей аминокислоты и т.д.
Идентификацию фенилтиопщантоиновых производных производят с помощью жидкостной хроматографии под давлением. На таком приборе можно определить последовательность значительно более длинных участков, чем при секвенировании вручную, причем гораздо быстрее. /зива 4 Пептид Х Пептид с. с. ц~ццци н юц фрагмент пептида Х фрагмент пептида 1Г н о н Я ц Фенилтиогидантоиноаая кислота н..нит н„О метан о н и Фенилтиогидантоин и пептид, укороченный на один остаток н н о Взаимодейстаие пептида с фенилиаотиоцианатом (реагентом Здмана1 Рис. 4.И. Образование фенилтиогидантоина из аминокислоты (или 1цг-концевого остатка полнпептида). Фенилизотиоцианат реагирует с амнногруппами аминокислот или пептидов с образованием фенилтиогидантоиновых производных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
