Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 16
Текст из файла (страница 16)
ДЕНАТУРАЦИЯ Сравнительно слабые связи, ответственные за стабилизацию вторичной, третичной и четвертичной структуры белка, легко разрушаются, что приводит к потере его биологической активности. Такое разрушение нативной структуры называют денатурацией. С физической точки зрения денатурацию можно Денетурецин )нетиенми) Неентиенмй )аенетурнроееннмй) Фермент Фермент Рис.' 5.8.
Схематичеокое изображение денатурации прото- мера. рассматривать как разупорядочение конформации полипептидной цепи без изменения первичной структуры. Если речь идет о протомере, то процесс можно представить так, как это показано на рис. 5.8. При денатурации олигомерного белка происходит диссоциация на протомеры, которая может сопровождаться или не сопровождаться изменением их конформации. Большинство белков теряют биологическую активность в присутствии сильных минеральных кислот или оснований, при нагревании и обработке ионными детергентами (амфифильными соединениями), хаотропными агентами (мочевнной, гуанидином), тяжелыми металлами (Ая, РЬ, Н8) или органическими растворителями. Денатурированные белки обычно менее растворимы в воде и часто из водного раствора выпадают в осадок.
Это свойство широко используется в клинической лаборатории. Пробы крови или сыворотки, взятые для анализа на содержание в ннх малых молекул (глюкозы, мочевой кислоты, лекарственных препаратов), сначала обрабатывают трихлоруксусной, фосфовольфрамовой или фосфомолибденовой кислотой для осаждения белка. Осадок удаляют центрифугированием, а свободную от белка надосадочную жидкость анализируют.
Чувствительность болыпппства ферментов к нагреванию, кислотам и иротеазам позволяет провести предварительное тестирование на фермеитативиый характер реакция. Если клеточный экстракт обладает каталитической активностью и теряет ее после кипячения, подкисления среды и последующей ее нейтрализации или после обработки какой-либо протеазой, то можно предположить, что катализатором служит фермент. Часто на процесс денатурацни оказывает влияние присутствие субстрата.
Этот эффект объясняют конформационными изменениями фермента, сопровождающими связывание субстрата. Новая конформация может быть более стабильна или менее стабильна, чем исходная. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ Сначала сложные белки освобождают от простетических групп (например, от гема) и окисляют днсульфидные группы; в результате образуются линей- Белки: структура и свойства Таблица 5.4. Модификация групп «-СООН и «-(ЧН . находя- щихся в составе белков ' А-цепь Глнцнн «-ХН «-соон Амнл А!а Авр А!а Авр В-цепь Фвннлвлвннн 7 О!у О1у Ме1 Ме1 Бег ТЬг Бег ТЬг Туг Уа! Уа! " С изменениями, из работы Ну И., %«16 Р.: Ровпгвпв!айопа1 сова!еп! шобй)св6оп оГ ргоге(пв. Ягннак 1977: 198: 890, с любезного разрешения авторов.
ные полипептилы (см. рис. 4.10). Методы секвенирования этих полнпептидов уже обсуждались в гл. 4. Большинство белков содержит только те аминокислоты, которые перечислены в табл. 3.3, однако в некоторых белках встречаются производные этих аминокислот (табл. 5.4 и 5.5). Методы идентификации производных аминокислот выходят за рамки данной главы; отметим только, что их присутствие усложняет определение первичной структуры. Первичная струк'гура инсулина и рибонуклеазы Инсулин состоит из двух полипептндных цепей, ковалентно связанных дисульфидными связями (рис.
5.9). В А-цепи на Х-конце находится остаток 61у, а на С-конце — Азп; в В-цепи Х- н С-концевыми остатками являются Р)зе и А1а соответственно. При окислении инсулина надмуравьиной кислотой дисульфидные связи между А- и В-цепямн разрываются. В ходе биосинтеза обе цепи вначале находятся в составе одной полипептидной цепи проиисулниа, кото- Таблица 5.5. Модифицнрусмыс функцнональныс группы в боковых цепях аминокислот в составе белков" — ОН -)Ч (в боковой цепи) РО~Н Х-метил Х-лиметнл (ч-триметнл Агй Н!в ).ув Агй Бег ТЬг Туг " С изменениями, из работы 1)у а., %«16 Р.: Ров«та«в!а6опа! сова!в«1 ш«61йс«6оп оГ ргоге(пв.
бг!енсе: 1977: !98: 890, с лвобезного разрешения авторов. Авр Иц О)у Н)в Ме1 РЬе Рго Х-формнл 1Ч-вцетнл 1Ч-метил Рис. 5.9. А- и В-цепи инсулина человека, соеднйнные ли- сульфнднымн связями. рый после синтеза подвергается протеолитическому процессингу„ведущему к образованию инсулина (гл. 51). Рибонуклеаза состоит из одиночной цепи длиной 124 остатка, с 1.уз на Х-конце и Уа1 на С-конце.
Восемь остатков цнстеина соединены дисульфидными связями, так что в белке образуются четыре поперечные связи (рис. 5.10). ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВТОРИЧНОЙ И ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ МЕТОДОМ РЕНТГЕНОВСКОЙ КРИСТАЛЛОГРАФИИ Ранее для выявления спиральных структур в белках широко использовались такие методы, как дисперсия оптического вращения и тритиевый обмен лабильных протонов; в дальнейшем все этн методы были вытеснены гораздо более мощным методом рентгеновской кристаллографии.
В этом случае необходимо получить белок в кристаллическом виде. Кроме того, нужно, как правило, иметь еще н кристалл производного этого же белка, содержащего ионы тяжелых металлов. Рентгеновские лучи, про- и и»» и и и и»»»»»»»» в Рис. 5 10. Структуры бычьей рибонуклеазы. Последовательность аминокислотных остатков представлена в виде двумерной схемы: изображены дисульфидные связи. Стрелки указывают направление пептидной цепи.
начиная с Х-конца. (Из работы БшугЬ О.О.. 51е!и %. Н.. Мооге 5.: ТЬе вег)пенсе оГ алано ас16 гев(днев !п Ьов(пе рапсгеа(гс пЬопцс)сазе. Кета!опз апд сопГогпза1(опв. Х В(ой СЬеюя. 1963:238:227, с любезного разрешения.) Гиииа 5 Центрифугироваиие в градиенте плотности сахарозы ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ Фильтрация через молекулярные сита Вначале проводят калибровку колонки с сефадексом или сходным наполнителем, используя набор белков известной молекулярной массы. Затем оценивают молекулярную массу неизвестного белка, сравнивая его подвижность с подвижностью стандартов. Однако, если белок представляет собой высокоасимметричную молекулу илн же взаимодействует с на- Таблица 5.6.
Че|верз ичиая сгруктура некоторых фсрмси гов': Фермснз !олвгомер) Молекулярная масса проз омара Число прогом еров Аспартат-трвисаминвза из сердца курицы (1.-аспартвт: 2-кетогдутарат амииотраисферазв, КФ 2.6.1.1) Сиитаза жирных кислот из печени голубя Фрукгозо-бисфосфатаза из печени кролика (О-фруктозо-!,б-бисфосфаг- 1-фосфогидродвза, КФ 3.1.3.11) Ориитиитраисамиивзв из печени крысы ().-ориитии:2-кетокисдота- амииотраисфераза. КФ 2.6.1.13) Пропиоиил-СоА-карбоксилаза из сердца свиньи (пропиоиил-СоА:СО. лигаза 1АОР), КФ 6.4.!.3) Лактатдегидрогеиаза (ЛДГ) из сердца. печени иди мышцы быка ().-лактат: )ЧАВ- оксидоредуктвзв, КФ 1.1.1.27) Митохондриальная АТРаза из сердца быка (АТР-фосфогидролаза, КФ 3.6.! З) Глутамиисиитвза из Е.
соб ().-глутвмат. )чН лигаза 1АОР), КФ 6.3.1.2) Ацетил-СоА-кврбоксидвза из печени курицы (ацетил-СоА: СО» лигаза 1АВР], КФ 6.4.1.2) 50 000 230 000 29 000 37 000 33 000 2 зи 2и 4 4" 10 4о 500 4 100000 409000 )з 2и 10и " Из обзора К!о!х !. М., ! апаеппап )Ч.И., )Эагпа!! )Э.%.: Яма!егпагу апис!иге оГ епхуглеа.
Аиии. яеа. Вюсйсги. !970:39:25. -"' Нсиаснтвчвые субьсдвнвцы. ходя через кристалл, рассеиваются. причем распределение интенсивности рассеяния зависит от распределения электронной плотности в кристалле. Распределение интенсивностей регистрируют с помощью фотографической пленки и расчетным путем получают карты электронной плотности. По этим картам (в виде плоских сечений), наложенным друг на друга. получаю~ достаточно достоверную модель рассматриваемого белка.
Рентгеновская кристаллография является дорогостоящим методом. требует больших затрат времени н солидного профессионального опыта„но в итоге она позволяет получить очень подробную и точную картину взаимной ориентации всех аминокислот во многих белках. Ее вклад в на!пи сегодняшние представления о структуре белка трудно переоценить.
Определение четвертичной структуры олигомерных белков включает идентификацию протомеров каждого типа, определение их взаимной ориентации и изучение взаимодействий, стабилизирующих всю структуру. Для определения молекулярной массы олигомера пригодны мно~ие из применяемых для этой цели методов, лишь бы они не приводили к денатурацни олигомера. Если же предварительно провести денатурацию олигомера, то можно теми же методами определить молекулярную массу протомера. Ультрацентрифугирование Этот метод, разработанный Сведбергом, основан на измерении скорости седиментации (осаждения) под дейсз вием центробежных снл, которые созданутся в ультрацентрифуге при ускорении порядка 10-~.
Набор белковых стандартов и исследуемый белок наслаивают поверх налитого в пластмассовую пробирку раствора сахарозы. плотность которого изменяется так. что образуется градиент концентраций от 5 до 20%; далее в гечение ночи проводят центрифугирование при -10'~. После этого дно пробирки прокалывают иголкой, содержимое собирают по каплям в небольшие пробирки, устанавливают относителыюе положение белков вдоль градиента плотности и проводят необходимые расчеты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
