Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Вращение пестика с контролируемой скоростью создает силы вязкого трения, под действием которых клетки разрушаются и их содержимое высвобождается в раствор сахарозы. Полученную суспензию, содержащую многие интактные (неповрежденные) органеллы, называют гомогеиатом. В. Цеитрифугирование. Субфракционирввание гомогената путем дифференциального центрифугирования — это один из наиболее важных методов биохимии. В классическом случае используются три стадии центрифугирования при возрастающих скоростях (рис. 2.2).
В ходе каждой из них образуются осадок и надосадочная жидкость (супернатант). Супернатант, полученный на каждой из стадий, подвергается центрнфугированию на следующей стадии. В результате этой процедуры образуются три типа осадков, которые называют ядерной, митохондрнальной н микросомной фракциями. Ни одна из этих фракций не представляет собой абсолютно чистые органеллы. Однако с помощью электронного микроскопа, а также путем идентификации соответствующих «маркерных» ферментов и химических компонентов (например, ДНК нли РНК) было установлено, что Таблвввк 2А. Основные клеточные органеллы и их функции. Перечислены только главные функции каждого типа органелл.
В р(ще случаев в этих органеллах могут протекать и другие процессы н реакции, функционировать другие метаболические пути Органеллв нлн фракция ' Основные функция Маркер ДНК Область локализации хромосом Область ДНК-зависнмого синтеза РНК (транскрипция) Цикл лимонной кислоты, синтез АТР Синтез белка (трансляция мРНК) Глутаматдегидрогеназа Высокое содержание РНК Глюк озо-б-фосфатаза Митохондрия Рибосома " Эндоплазматнческий ре- тикулум Кислая фосфатаза Лизосома Ма/К -АТРаза 5'-нуклеотндаза Галактознлтрансфераза Плазматическая мембрана Аппарат Гольджн Пероксисома Цитоскелет " Цитозоль " Процесс гликолиза, синтез жирных кислот " Оргянеллу можно определить кек ограниченную мембраной субклеточную структуру, которую можно выделять прн высокоскоростном центрнфугнровяннн.
Согласно этому определенню, рнбосомы, цнтоскелет н цнтоюль не являются органеллвмн. Однако в этой теблнце онн перечислены вместе с органеллвмн, поскольку нх тоже обычно выделяют путем центрнфугнроввння. Их можно рвссматрнввть квк субклеточные обряэоввння нлн фракция. Препарат органелл, вылаленных в ходе одного цикла дифференциального центрнфугнровяння, редко бывает чистым; чтобы получать чистую фракцию, обычно приходится центрнфугнроввть препарат по меньшей мере несколько рвэ. *' Фракция цнтоскелета ндентнфнцнруется с помощью электронной мнкроскопнн нлн путем электрофоретнческого анализа на содержание спецнфнчньгк для этой фрвкцнн белков.
упернвтемт (31 Суоермвтянт (2( Супернетемт (11 гб ООО р к $ мин 106 ООО У н 60 мин 600 У х 10 мин Ммкросомнвя ф(жкцнй Ядерная фракция Рис. 2.2. Схема разделения субклеточных фракций с помощью дифференциального центрифугирования. Гомогенизнрованную ткань (например, печень) сначала центрифугируют прн малой скорости, что приводит к осаждению ядерной фракции (содержащей ядро и неразрушенные клетки) и отделению супернатанта (1). Супернатанг осторожно сливают (декантируют) и проводят цеитрифугирование при более высокой скорости, в результате чего разделяются митохондриальная фракция (содер1кащая митохондрии, лнзосомы и пероксисомы) и супернатапт (2).
Последний декантируют и центрифугируют при высокой скорости, в результате чего формируется мнкросомная фракция (содержащая смесь свободных рибосом и фрагментов гладкого и шероховатого эндоплазматического ретнкулума) и отделяется чистый прозрачный раствор — конечный супернатант (3). Последний представляет собой цитозоль, нли клеточный сок. Используя различные модификации представленного здесь подхода, обычно выделяют каждую из клеточн(ях органелл в относительно чистом виде.
Каталаза Оксидаза мочевой кислоты Специфические ферменты-маркерыы отсутствуют Лактат-дегидрогеназа Связанные с мембранами рибосомы являются главным местом синтеза белка Синтез различных липидов Окисление многих ксенобиотнков (цнтохромом Р-450) Место действия многих гидролаз (ферментов, катализирующих реакции гидролитического расщепления) Транспорт молекул в клетку н из клетки, межклеточная адгезня и межклеточные коммуникации Внутриклеточная «сортировка» белков Реакции гликозилнрования Реакции сульфатирования Деградация некоторых жирных кислот и аминокислот Образование и разложение перекиси водорода Опорные функции (микрофиламенты, микротрубочкн, промежуточные филаменты) 16 главными компонентами этих трех фракций являются ядра, митохондрии и микросомы соответственно.
«Маркерный» фермент или химическое соединение †э тот компонент, который присутствует практически только в составе данного типа органелл; например, кислая фосфатаза находится в лизосомах, а ДНК вЂ” в ядре (табл. 2.4). Таким образом, маркер служит индикатором присутствия или отсутствия фракции тех органелл, в составе которых он находится. Мпкросомпая фрикции (микросомы) представляет собой в основном смесь фрагментов гладкого эндоплазматического ретикулума, шероховатого эндоплазматического ретикулума (т.е. эндоплазматического ретикулума с присоединенными к нему рибосомами) и свободных рибосом.
Содержимое супернатанта, полученного на конечной стадии, приблизительно соответствует составу клеточного сока (цитозоли). Модификации этого основного подхода, основанные на использовании различных сред для гомогенизации, разных условий или методов центрифугирования (например, использование непрерывного или ступенчатого градиента сахарозы), позволилн выделить в более или менее чистом виде все органеллы, показанные на рис.
2.1 и перечисленные в табл. 2.4. Описанная выше схема применима к большинству органов и клеток, однако в каждом случае для стандартизации процедуры субклеточного фракционирования необходимо провести серию анализов на содержание маркерных ферментов или других химических компонентов, а также выполнить электронно-микроскопические наблюдения. Значение субклеточного фракционирования для развития биохимии и клеточной биологии невозможно переоценить. Оно составляет одно из главных звеньев общего экспериментального подхода (см. ниже), с помощью которого удалось выяснить функции органелл, перечисленные в табл. 2.4. Получение этой информации представляет одно из главных достижений биохимических исследований (см. ниже).
ОБЩИЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПОДХОД, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В БИОХИМИИ Этот подход состоит из трех составных частей: 1) выделение бпомолекул п оргаиелл, находящихся в клетке (см. предыдущий раздел о субклеточном фракционировании); 2) определение структуры бпомолекул; 3) использование различных препаратов для анализа функций бцомолекул и пх метаболизма (т.е. процессов синтеза и распада). 1.
Выделение бпомолекул. Как и в случае органелл, для выяснения функции любой биомолекулы необходимо прежде всего получить ее в чистом виде. В табл. 2.5 перечислены основные методы, используемые для разделения н очистки биомолекул. Здесь мы не будем подробно обсуждать их: некоторые из них будут вкратце описаны в других частях книФи. Таблица 2.5. Основные методы разделения и очистки биомолекул. БЬльшая часть этих методов пригодна для анализа компонентов, находящихся в клеточных экстрактах и других биохимических препаратах.
Для получения большинства биомолекул в чистом виде, как правило, необходимо последовательно использовать несколько методов. Подробности о применении каждого из методов читатель может найти в соответствующих руководствах Фраицвеяироваиие солями (например, осаждение с сульфатом аммония) Хроматография Бумажная Ионообменная (анионо- и катионообменная) Аффннная Тонкослойная Газо-жидкостная Жидкостная под высоким давлением Гель-фильтрация Элеитрофорез На бумаге Высоковольтный В агарозе В ацетатцеллюлозе В крахмальном геле В полиакриламиде В полиакриламиде в присутствии додецилсульфата натрия Ультрацеитрифутнроааиие Почти всегда очистить биомолекулы до состояния гомогенности (т.е.
до отсутствия загрязнения любыми другими биомолекулами) удается лишь при последовательном применении нескольких таких методов. Важно иметь в виду, что прогресс в биохимии зависит от разработки новых методов анализа, очистки и определения структуры. Например, в области биохимии липидов произошел настоящий переворот после введения в практику газо-жидкостной и тонкослойиой хроматографии. Анализ мембранных и многих других белков был крайне затруднен до тех пор, пока не появился метод электрофореза и полпакрплампдпом геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПЭГ): применение додецилсульфата натрия приводит к «солюбилизации» (растворению) ряда белков, которые ранее не удавалось перевести в растворимое состояние. После такой солюбилизации уже можно проводить электрофорез.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
