Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Метод радиоавтографии имеет довольно низкую разрешающую способность - порядка нескольких сотен ангстрем. Однако у этого методаесть определенное преимущество: он позволяет видеть лишь те молекулы, которые содержат метку. Для того чтобы сделать ДНКвидимой при радиоавтографии, в нее включают тимин или тимидин, меченный тритием.28Часть IV.ИнформацияРис. 24.34.Радиоавтограф реплицирующейся ДНК Е.
coli. (Печатаетсяс любезного разрешения д-раJohn Gairns.)На радиоавтографах и электронных микрофотографиях видно, что реплицирующаяся ДНК E.coli имеет форму замкнутогокольца с внутренней петлей (рис. 24.34). Молекулы такой формы называют тета-структурами, так как они напоминают греческуюбукву θ (рис. 24.35). Тета-структуры показывают, что молекулы ДНК сохраняют во время репликации кольцевую форму. Разрешение этого метода недостаточно велико,чтобы различить свободные концы. Однакоочевидно, что длинных нитей одноцепочечной ДНК в молекуле нет. Таким образом,эти изображения позволяют отвергнуть механизм репликации, согласно которому цепи родительской ДНК сначала полностьюраскручиваются, и только затем используются в качестве матриц при синтезе новойДНК.
Напротив, синтез новой ДНК сопряжен с одновременным раскручиванием родительской ДНК. Участок, где происходитодновременное расплетание и синтез, называется репликационной вилкой.Рис. 24.35.Схематическоеизображениекольцевой хромосомы Е. coli вовремя репликации. Синимилиниями в этой тета-структурепоказана родительская ДНК,красными - новообразованнаяДНК.Рис. 24.36.Относительныеколичестваразличных генов в условияхбыстрого синтеза ДНК у Е. coliв зависимости от их положенияна генетической карте.24.18. Репликация ДНК начинается в строгоопределенном месте и продолжаетсяпоследовательно в обоих направленияхНачинается ли репликация ДНК E.coliв произвольном месте хромосомы, или жев хромосоме имеется определенный участокинициации? Репликация ДНК - строго регулируемый процесс, поэтому a priori кажется гораздо более вероятным, что она начинается в определенном месте.
Действительно, как показали работы по определению относительного числа различных геновв условиях быстрого синтеза ДНК, репликация в клетках E.coli начинается в одномопределенном месте хромосомы. Рассмотрим два гена - а и b. Предположим, что гена расположен вблизи от точки начала репликации, а ген b - вблизи от конца. Тогда гена будет реплицироваться намного раньше,чем ген b. В быстро растущей культуре наодин ген b будет приходиться примерно двагена а.
Если же, наоборот, репликация ДНКначинается в случайной точке, количествогенов а и b будет одинаковым. Относительное число генов было определено с помощью метода гибридизации, который рассматривается ниже (разд. 25.5). Результатыэтих экспериментов ясно показали, что относительное число генов действительно зависит от их положения на карте (рис. 24.36).Эти данные позволили сделать следующиевыводы.1. Репликация начинается в строго определенном уникальном участке - вблизи генаilv, локализованного на 74' на стандартнойгенетической карте E.coli.2.
Репликация идет одновременно в обоих направлениях с примерно одинаковой24. ДНК: генетическая роль,структура и репликация29скоростью. Другими словами, существуютдве репликационные вилки: одна движется почасовой стрелке, другая - против часовойстрелки.3. Две репликационные вилки встречаются вблизи маркера trp (25' на генетическойкарте) - в точке, почти диаметрально противоположной началу репликации.Еще одно доказательство двунаправленности репликации ДНК у E.coli было получено методом радиоавтографии.
Для этоговначале репликацию проводили в среде, содержавшей тимин, меченный тритием доумеренной удельной радиоактивности. Через несколько минут инкубации бактерииперенесли в среду, содержавшую высокомеченный тритием радиоактивный тимин.Пробы с двумя различными уровнями радиоактивности использовались для того,чтобы получить на радиоавтографах два типа цепочек зерен серебра: цепочки с низкойплотностью зерен, соответствующие ДНК,синтезированной вначале, и цепочки с высокой плотностью, соответствующие ДНК,синтезированной позже. Если бы репликация шла в одном направлении, были бывидны цепочки с высокой плотностью зеренна одном конце и низкой плотностью надругом. Если же репликация идет в двух направлениях, середина каждого отпечаткаДНК должна была бы иметь низкую плотность зерна, а концы - высокую (рис.
24.37).Радиоавтографы дали наглядный ответ(рис. 24.38). Цепочки зерен серебра (отпечатки ДНК) во всех случаях имели более высокую плотность зерен на обоих концах, чемпосередине, указывая тем самым, что репликация хромосомы E.coli идет в двух направлениях.Рис.
24.37.Предполагаемые результатырадиоавтографиивслучаеодно- и двунаправленной репликации, если бактерий переносят со среды, содержащей тимин с умеренной радиоактивностью, на среду с высокорадиоактивным тимином.Рис. 24.38.Радиоавтограф ДНК Е. coli вовремя репликации (условияопыта указаны в подписик рис. 24.37). Наблюдаемоераспределение зерен серебрапоказывает, что репликацияидет в двух направлениях.[Prescott D. M., Kuempel P.L.,Proc. Nat. Acad. Sci, 69, 2842(1972).]Рис.
24.39.При низком разрешении кажущееся направление репликацииДНК будет 5'—>3' для однойдочерней цепи и 3'—>5' длядругой. На самом деле обе цеписинтезируются в направлении5'—>3',как показано нарис. 24.40.24.19. Одна цепь ДНК синтезируетсяпрерывистоВернемся к взаимодействию молекул прирепликации. В области репликационнойвилки обе цепи родительской ДНК служатматрицами для синтеза новой ДНК. Напомним, что цепи родительской ДНК антипараллельны. Следовательно, общее направление синтеза ДНК должно быть 5'—>3' дляодной из дочерних цепей и 3'—>5' для другой(рис.
24.39). Однако все известные ДНК-полимеразы синтезируют ДНК в направлении5'—>3', а не 3'—>5'. Как же тогда происходит30Часть IV.Информациякажущийся (при низкой разрешающей способности метода) рост одной из дочернихцепей в направлении 3'—>5'?Проблема была решена Рейдзи Оказаки(Reiji Okazaki), который обнаружил, что значительнаячастьновосинтезированнойДНК существует в виде коротких фрагментов.
Такие фрагменты длиной около 1000нуклеотидов (они называются фрагментамиОказаки) существуют в течение непродолжительного времени в непосредственнойблизости от репликационной вилки. По мере прохождения репликации эти фрагментысоединяются друг с другом ковалентно поддействием ДНК-лигазы и образуют одну издочерних цепей (рис. 24.40).
Другая новаяцепь синтезируется непрерывно или почтинепрерывно. Та цепь, которая образуется изфрагментов Оказаки, называется отстающей цепью, а та, что синтезируется без разрывов или почти без разрывов,- ведущейцепью. И фрагменты Оказаки, и ведущаяцепь синтезируются в направлении 5'—>3'.Прерывистая сборка отстающей цепи позволяет путем полимеризации в направлении5'—>3' на атомном уровне получать общийрост цепи в направлении 3'—>5'.Рис. 24.40.Схематическоеизображениерепликационной вилки.
Обе цепи ДНК синтезируются в направлении 5'—>3'. Ведущаяцепь синтезируется непрерывно, а отстающая - в виде коротких фрагментов (фрагментыОказаки).Рис. 24.41.Инициация синтеза ДНК.А - праймаза синтезирует короткуюкомплементарнуюцепь РНК; Б - эта РНК служитзатравкой для синтеза новойДНК; В - РНК, входящая в состав новообразованной цепи,гидролизуется, при этом образуется брешь, которая впоследствии заполняется.24.20.
Затравкой синтеза ДНК служитРНККак начинается синтез ДНК? Напомним,что всем ДНК-полимеразам для инициирования синтеза ДНК необходима затравка сосвободной 3'-ОН-группой. Что служит затравкой при синтезе ведущей цепи и фрагментов Оказаки? Важным толчком к решению этого вопроса послужило наблюдение,что для инициации синтеза ДНК необходимсинтез РНК. На основе этого открытия было высказано предположение, что РНК, очевидно, служит затравкой в синтезе ДНК, таккак уже было известно, что РНК-полимеразы способны начинать синтез цепей denovo. Затем было показано, что новообразующаяся ДНК ковалентно связана с коротким фрагментом РНК, который и служит затравкой.Итак,РНК-затравкав синтезе ДНК.По всей вероятности, репликация ДНКв клетке E.coli происходит, как показано нарис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
