Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Эта 5'—>3'-нуклеазная активность(рис. 24.29) существенно отличается от обсуждавшейся выше 3'—>5'-экзонуклеазнойактивности.Во-первых,расщепляемаясвязь должна находиться в двухспиральном участке. Во-вторых, может происходить расщепление как концевой фосфодиэфирной связи, так и связи, расположеннойна расстоянии нескольких нуклеотидов от5'-конца (который может иметь свободнуюили фосфорилированную гидроксильнуюгруппу).
В-третьих, 5'—>3'-нуклеазная активность увеличивается, если одновременно идет синтез ДНК. В-четвертых, активный участок 5'—>3'-нуклеазной активности четко отделен от активных участковполимеризации и 3'—>5'-гидролиза. ДНКполимеразу I можно расщепить протеолитическими ферментами на фрагмент с массой 36 кДа, содержащий всю 5'—>—>3'-нуклеазную активность, и фрагментс массой 75 кДа, содержащий всю полимеразную и всю 3'—>5'-экзонуклеазную активности.
Таким образом, ДНК-полимераза I содержит по меньшей мере дваРис. 24.28.3'—>5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I.Рис. 24.29. 5'—>3'-нуклеазная активностьДНК-полимеразы I.различных фермента в одной полипептидной цепи. 5'—>3'-нуклеаза дополняет 3'—>—>5'-экзонуклеазную активность, исправляяошибки другого рода. Например, 5'—>—>3'-нуклеаза участвует в вырезании пири24. ДНК: генетическая роль,структура и репликация25Рис. 24.30.ДНК-лигаза катализирует соединение двух цепей ДНК, входящих в состав одной двухспиральной молекулы.Рис.
24.31. Ковалентный промежуточныйкомплекс фермент—AMP.мидиновых димеров, образующихся приоблучении ДНК ультрафиолетом (разд.24.24). Более того, 5'—>3'-нуклеазная активность играет ключевую роль в самойрепликации ДНК (разд. 24.19).24.15. ДНК-лигаза соединяетфрагменты ДНКДНК-полимераза I может присоединятьдезоксирибонуклеотиды к затравочной цепи, но она не способна катализировать соединение двух цепей ДНК или замыканиеодной цепи ДНК. Обнаружение кольцевойДНК указывало, что такой фермент должен существовать. В 1967 г. в несколькихлабораториях одновременно была открытаДНК-лигаза - фермент,катализирующийобразование фосфодиэфирной связи междудвумя цепями ДНК (рис.
24.30). Ферментэтот активен при наличии свободнойОН-группы на 3'-конце одной цепи ДНК и26Часть IV.Информацияфосфатной группы на 5'-конце другой. Образование фосфодиэфирной связи междуэтими группами - эндергоническая реакция.Следовательно, для реакции соединения цепей требуется источник энергии. У Е. coliи других бактерий эту роль выполняетN A D + , тогда как в клетках животных и зараженных бактериофагом клетках даннаяреакция осуществляется за счет энергииАТР.Заслуживает внимания и еще один аспект работы ДНК-лигазы: ДНК-лигаза неможет соединить две молекулы одноцепочечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемыеДНК-лигазой, должны быть частью двухцепочечной молекулы ДНК.
Исследованиямодельных систем дают основание думать,что ДНК-лигаза образует фосфодиэфирную связь только в том случае, если вблизи от места разрыва имеется хотя бы несколько пар оснований. В действительности ДНК-лигаза заделывает одноцепочечные разрывы в остове двухспиральнойДНК. Этот процесс необходим для нормального синтеза ДНК, для репарации поврежденной ДНК и для сращивания(сплайсинга) цепей ДНК при генетическойрекомбинации.Рассмотрим механизм этой реакции,установленный Робертом Леманом (RobertLehman). ATP или NAD + вступают в реакцию с ДНК-лигазой и образуют ковалентный комплекс фермент-AMP, в которомAMP связан с ε-аминогруппой лизиновогоостатка фермента фосфоамидной связью(рис.
24.31). Остаток AMP активирует фосфатную группу на 5'-конце ДНК. Последняя стадия - нуклеофильная атака активированного атома фосфора 3'-ОН-группой.В результате образуется фосфодиэфирнаясвязь и освобождается AMP. Движущаясила этой последовательности реакций - гидролиз пирофосфата, отщепляющегося приобразовании комплекса фермент—аденилат. Таким образом, на образование фосфодиэфирной связи в остове ДНК расходуют-Рис. 24.32.Механизм реакции, катализируемой ДНК-лигазой.ся две богатые энергией фосфатные связи.если источником энергии служит АТР.24.16. Открытие ДНК-полимераз II и IIIМы видели, что ДНК-полимераза I можетсинтезировать и репарировать ДНК in vitro.Выполняет ли она эти функции in vivo? Вопрос вполне правомерный, так как ферментне всегда способен осуществлять in vivo туреакцию, которую он катализирует in vitro.Условия, существующие в клетке, могут отличаться от условий, используемых при постановке опытов in vitro, и, кроме того,в клетке могут присутствовать другие ферменты.
Действительно, в клетке E.coliимеются по меньшей мере две другие ДНКполимеразы, названные полимеразами IIи III, которые были обнаружены примерночерез 15 лет после открытия ДНК-полимеразы I. Чем же объясняется такое запаздывание? Дело в том, что активность ДНК-полимераз II и III маскировалась высокойактивностью полимеразы I.Ситуация изменилась в 1969 г., когда Паула Де Лусия и Джон Кэрнс (Paula DeLucia,John Cairns) выделили мутантную формуE.coli, в экстракте которого обнаруживалосьот 0,5 до 1% нормальной полимеразной активности ДНК-полимеразы I по сравнениюс обычными клетками. Этот мутант (обозначенный polA 1) размножался с такой жескоростью, как и родительский штамм.Кроме того, многие фаги размножалисьв клетках polA 1 так же хорошо, как и в родительских клетках.
Однако этот мутант гораздо быстрее погибал под действием ультрафиолетового облучения. К тому жемутант polA 1 был более чувствителен к летальному действию химического мутагенаметилметансульфоната. Де Лусия и Кэрнссделали вывод, что репликация ДНК в клетках полученного ими мутанта polA 1 идетнормально, но репарация ДНК существеннонарушена. Они предположили, что для син-теза ДНК нужна какая-то другая полимераза, отличная от ДНК-полимеразы I.Низкий фон активности полимеразы Iу мутанта polA 1 облегчил поиск новыхДНК-полимераз. Вскоре в нескольких лабораториях были выделены и охарактеризованы два таких фермента.
ДНК-полимеразыII и III подобны полимеразе I в следующихотношениях:1. Они катализируют направляемый матрицей синтез ДНК из предшественниковдезоксирибонуклеозидтрифосфатов.2. Для проявления их активности необходима затравка со свободной 3'-ОН-группой,3. Синтез идет в направлении 5'—>3'.4. Они обладают 3'—>5'-экзонуклеазнойактивностью. ДНК-полимераза III (но не II)является также 5'—>3'-нуклеазой.Эти полимеразы различаются по характеру предпочитаемых ими матриц.
Для полимераз II и III оптимальными матрицамислужат двухцепочечные ДНК, имеющие короткие одноцепочечные пробелы. Полимераза I, наоборот, предпочитает протяженные одноцепочечные участки, соседствующие с двухспиральными участками.Максимальные скорости катализа in vitroдля этих ферментов также различаются: полимераза I присоединяет 10 нуклеотидовв секунду, а полимераза II - 0,5 и полимеразаIII - 150 нуклеотидов в секунду.
В физиологически активном состоянии ДНК-полимераза III ассоциирована с некоторыми другими белками. Этот мультисубъединичныйкомплекс называют голоферментом ДНКполимеразы III.Какова роль этих полимераз in vivo?Вскоре мы расскажем о том, что мультиферментный комплекс, содержащий ДНК-полимеразу III, синтезирует большую часть новообразующейся ДНК, а ДНК-полимеразаI удаляет затравку и заполняет пробелы.Роль ДНК-полимеразы II пока не установлена.
Проведенные в последнее время био24. ДНК: генетическая роль,структура и репликация27Рис. 24.33.Положение структурных геновтрех ДНК-полимераз Е. coli.Ген ДНК-полимеразы I расположен в локусе polA, ген ДНКполимеразы II - в локусе polBи ген ДНК-полимеразы III - влокусе dnaE.химические и генетические исследования показали, что, кроме ДНК-полимераз I и IIи ДНК-лигазы, для репликации ДНК в клетке E.coli необходимо более 10 белков. Прежде чем рассмотреть взаимодействие этихбелков с ДНК, познакомимся в общих чертах с репликацией на уровне целой хромосомы.24.17.
Расплетание родительской ДНКи синтез новой ДНК происходятв репликационной вилкеИзображения ДНК во время репликациибыли получены с помощью радиоавтографии и электронной микроскопии. При радиоавтографии изображение образуетсяв результате распада подходящего изотопа,например трития. Испускаемые электронывзаимодействуют с гранулами серебра фотографической эмульсии. После проявленияпленки возникают черные точки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
