Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Например, EcoRI расщепляет кольцевую двухцепочечную ДНК вируса SV-40 длиной 5,1 kb только в одномместе, Нра - в четырех местах и Hind - в 11местах. Кусок ДНК, образованный однимферментом рестрикции, можно специфически расщепить на более мелкие фрагментыс помощью другого фермента. Используянесколько ферментов рестрикции, можнокартировать хромосомы (разд. 31.8). Болеетого, набор фрагментов, полученных с помощью ферментов рестрикции, может служить своего рода «отпечатком пальца»для соответствующей молекулы ДНК. Небольшие различия между сходными молекулами ДНК можно легко выявить с помощью электрофоретического разделенияих рестрикционных фрагментов. Для каждого данного геля электрофоретическаяподвижность фрагмента ДНК обратнопропорциональна логарифму числа пар оснований (до определенного предела длиныфрагментов).
Для разделения фрагментовДНК длиной до 1000 пар оснований используют полиакриламидный гель, а для24.28. Последовательность нуклеотидовв ДНК можно быстро определитьс помощью специфического химическогорасщепленияПоявление надежных методов определенияпоследовательности нуклеотидов в молекулы ДНК облегчило также изучениеструктуры ДНК и ее связи с экспрессиейгена. Метод химического расщепления, разработанный Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом (Allan Maxam, WalterGilbert), основан на использовании ДНК,меченной 32 Р по одному из концов однойиз цепей.
Для введения 32 Р в 5'-гидроксильный конец обычно используют полинуклеотидкиназу. Меченую ДНК расщепляют предпочтительно по одному из четырех нуклеотидов. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждуюцепь приходился в среднем один разрыв.Рис. 24.48.Специфичность некоторых эндонуклеаз рестрикции. Последовательности пар оснований,узнаваемые этими ферментами, имеют ось симметрии второго порядка. Две цепи ДНКв этой области симметричныотносительно оси, обозначенной зеленым овалом.
(Однацепь сдвинута относительнодругой на 180°.) Места расщепления показаны краснымистрелками. Сокращенные названия каждого фермента рестрикции приведены справа отпоследовательности, которуюон узнает.разделения более длинных молекул болеепористый агарозный гель. Если ДНК содержит радиоактивную метку, полосыможно выявить методом радиоавтографии.В другом случае гель можно покраситьбромистым этидием, который при связывании с двухспиральной ДНК флуоресцируетярким оранжевым светом. При использовании этого способа можно легко увидетьполосу,содержащую50 нгДНК(рис.
24.49). Помимо чувствительности,важное достоинство таких гелей - их высокая разрешающая способность.Рис. 24.49.Электрофоретическое разделение фрагментов, образующихся при расщеплении ДНКSV-40 тремя различными ферментамирестрикции.Этифрагментыфлуоресцируютблагодаря тому, что гель окрашен бромистым этидием. (Печатается с любезного разрешения д-ра Jeffrey Sklar.)24. ДНК: генетическая роль,структура и репликация39Частичное расщепление по каждому основанию дает набор радиоактивных фраг32ментов, начинающихся Р-меткой и кончающихся одним из положений этогооснования. Например, если исследуемаяДНК имеет последовательность325'- P-GCTACGTA-3'то в результате специфического расщепления с 5'-стороны каждого из четырех оснований получатся следующие радиоактивные фрагменты:Затем эти фрагменты разделяют методомэлектрофореза в полиакриламидном геле,который дает возможность разделять молекулы ДНК, различающиеся по длиневсего лишь на один нуклеотид.
Следующий этап - радиоавтография этого геля.Как показано на рис. 24.50, самая нижняяполоса расположена на дорожке, соответствующей расщеплению по С, следующая - на дорожке Т, затем еще одна - надорожке А. Следовательно, последовательность первых трех нуклеотидов имеет вид5'-СТА-3'. Если прочитать все семь полосснизу вверх, получится последовательность5'-CTACGTA-3'. Итак, радиоавтограф геля,полученного после четырех различных реакций химического расщепления, дает наборполос, по которым можно непосредственнопрочитать нужную последовательность.Как достигается специфическое расщепление ДНК? Для этого используют соединения, которые способны модифицировать основание и затем отщеплять его отостатка сахара (рис.
24.51). Пурины модифицируют диметилсульфатом, метилирующим гуанин по N-7 и аденин по N-3. Расщепление гликозидной связи метилированного пурина легко достигается нагреванием при нейтральном значении рН.40Часть IV.ИнформацияВ результате основание отделяется от соответствующего остатка сахара. Затемсмесь нагревают в щелочи, что вызываетрасщеплениесахарофосфатногоостоваДНК и удаление остатка сахара. В результате образуются фрагменты, несущие наконце метку.
Эти фрагменты разделяютв полиакриламидном геле и на радиоавтографе получают картину полосы различной интенсивности. Темные полосы соответствуют фрагментам, образовавшимсяпри расщеплении по гуанину, так как гуанин метилируется гораздо быстрее, чемаденин. В то же время гликозидная связьв метилированном аденозине менее стабильна, чем в метилированном гуанозине.Поэтому при обработке разбавленной кислотой после метилирования происходитпредпочтительное выщепление аденина(получается дорожка А + G). Сравнение дорожки А + G с параллельной дорожкойG на том же геле показывает, происходитли расщепление по А или по G (рис.
24.52).Расщепление по цитозину и тимину проводят гидразином. Остов затем расщепляютРис. 24.50.Схематическое изображениегеля, на котором показаны радиоактивные фрагменты, образовавшиеся при специфическом расщеплении последовательности 5'-32P-GCTACGTA3' по каждому из четырех оснований (дорожки A, G, С и Т).Слева указано число нуклеотидов (n) в каждом фрагменте.Последовательностьоснований читается непосредственнос геля снизу вверх.24.29. Полная последовательностьоснований ДНК фага φХ174 былаопределена с помощью методаферментативной репликацииДругой метод определения последовательности оснований в ДНК основан на образовании меченых фрагментов с помощьюконтролируемогопрерыванияферментативной репликации in vitro. Этот методразработали Фред Сэнгер (Fred Sanger)и его сотрудники.
Для считывания определенной последовательности с одноцепочечной ДНК используют ДНК-полимеразуРис. 24.51.Стратегия метода определенияпоследовательности нуклеотидов в ДНК с помощью химического расщепления.пиперидином, который вытесняет продуктыреакции с гидразином и катализируетэлиминацию фосфатов. В результате расщепления по цитозинам и тиминам получают серию полос примерно равной интенсивности (дорожка С + Т). Эти пиримидины различают, проводя гидразинолизв присутствии 2 М NaCl, подавляющимреакцию с тимином (дорожка С). Теперь последовательность ДНК можно прочитатьпо радиоавтографу геля, сопоставляя дорожки G, A + G, С + Т и С (рис.
24.52).Самый короткий фрагмент имеет самуювысокую электрофоретическую подвижность, так что 5'-концу соответствует низгеля. Если использовать несколько различных гелей для разделений всех меченыхфрагментов, можно легко определить таким образом последовательности длинойболее 150 пар оснований.Рис. 24.52.На радиоавтографе геля виднымеченые фрагменты, образовавшиеся при химическом расщеплении. 5'-конец этой ДНКбыл помечен 32Р. Самый короткий нуклеотид расположену основания геля. С геля можнопрочитать последовательность5'-CTTTTTTGGGCTTAGC-3'.24.
ДНК: генетическая роль,структура и репликация41I 1 ) . В качестве затравки для синтеза используется комплементарный фрагмент,который можно получить из набора продуктов рестрикции, соответствующей двухцепочечной ДНК. Кроме четырех радиоактивных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов,инкубационная смесь содержит 2',3'-дидезоксианалог одного из них. Включение этого аналога блокирует дальнейший рост цепи, так как он не содержит концевой3'-гидроксильной группы, необходимой дляобразования следующей фосфодиэфирнойсвязи. Так образуются фрагменты, несущие на 3'-конце дидезоксианалог (рис.
24.53).Затем четыре набора фрагментов, образованных терминированием цепей, разделяютгель-электрофорезом и прочитывают последовательность оснований синтезированной ДНК по радиоавтографу геля. Используя менее 1 пмоль очищенной ДНК, можно определить последовательности 200 нуклеотидов.С помощью метода контролируемой репликации in vitro Сэнгер определил полную последовательность 5375 основанийв ДНК фага φХ174. Расшифровка последовательности ДНК целого генома - крупноедостижение молекулярной биологии. Онапозволила сделать ряд важных выводов,которыемырассмотримвгл.
26(разд. 26.11). Интересно отметить, что Сэнгер определил полную последовательностьоснований целого генома через четвертьвека после того, как он расшифровал аминокислотную последовательность белка2.1Поэтому данный метод в отечественной литературе называют методом полимеразного копирования.- Прим. перев.2Следует отметить, что в промежутке междуэтими открытиями Ф. Сэнгер разработал оригинальный метод определения последовательности оснований в РНК, который имел огромныепреимущества перед другими известными в товремя методами.- Прим. перев.42Часть IV.ИнформацияЗаключениеДНК - молекула наследственности у всехпрокариотических и эукариотических организмов.
У вирусов роль генетического материала выполняет либо ДНК, либо РНК.Любая клеточная ДНК представляет собойдве очень длинные спиральные полинуклеотидные цепи, закрученные вокруг общей оси. Две цепи двойной спирали ориентированы в противоположном направлении (антипараллельны). Сахарофосфатныйостов каждой цепи лежит снаружи двойнойспирали, а пуриновые и пиримидиновыеоснования - внутри. Две цепи удерживаются вместе водородными связями между парами оснований. Аденин (А) всегда спаривается с тимином (Т), а гуанин (G) - cцитозином (С). Таким образом, цепи двойной спирали взаимно комплементарны.
Генетическая информация закодирована в последовательности оснований вдоль цепи.Большинство молекул ДНК имеет кольце-Рис. 24.53.Стратегия метода определенияпоследовательности нуклеотидов в ДНК путем терминирования цепи. Фрагменты образуются в результате добавления2',3'-дидезоксианалогаодного из dNTP в каждую изчетырех пробирок, в которыхпроисходитполимеризация.Например, при добавлении дидезоксианалога dATP образуются фрагменты, оканчивающиеся на А (показанокрасным цветом).вую форму.
Ось двойной спирали кольцевой ДНК может сама закручиватьсяи образовывать суперспираль. Суперспирализованная ДНК имеет более компактнуюформу, чем релаксированная ДНК.При репликации ДНК две цепи двойнойспирали расплетаются и расходятся по мере того, как синтезируются новые цепи.Каждая родительская цепь служит матрицей для образования новой комплементарной цепи. Таким образом, репликацияДНК полуконсервативна - каждая дочерняямолекула получает одну цепь родительскоймолекулыДНК.РепликацияДНК - сложный процесс, в осуществлениикоторого участвует много белков, в томчислеДНК-полимеразытрехтипови ДНК-лигаза. Активированные предшественники синтеза ДНК - четыре дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты. Новая цепьсинтезируется в направлении 5'—>3'.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
