Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Однаковскоре после заражения появляется минорная фракция РНК с коротким временемжизни. Как уже говорилось выше, нуклеотидный состав минорной фракции РНКсходен с составом фаговой ДНК. Эта система представлялась оптимальной дляпроверки гипотезы посредника, посколькув ней происходило быстрое переключениеприроды синтезируемого белка.
Еще однопреимущество состояло в том, что в зараженных клетках не происходило синтезарРНК и тРНК.Рис. 25.3.Электронная микрофотография клетки E. coli, зараженнойвирусами Т2. (Печатается с любезного разрешения д-ра LeeSimon.)Как же происходит при заражении переключение синтеза с одних белков на другие? Одна возможность состояла в том,что фаговая ДНК программирует образование новых рибосом.
Согласно этомупредположению, гены определяют синтезспециализированных рибосом, а каждаярибосома может синтезировать белоктолько одного вида. Альтернативное предположение, выдвинутое Жакобом и Моно,состояло в том, что рибосомы - неспециализированные структуры, которые получают генетическую информацию от генав виде нестабильной информационнойРНК (посредника). Эксперименты Бреннера, Жакоба и Меселсона были спланированы таким образом, чтобы можно быловыяснить, происходит ли после заражениясинтез новых рибосом или же новообразованная РНК присоединяется к предсуществовавшим рибосомам.Бактерии выращивали в среде, содержав1513шей тяжелые изотопы ( N и С), заражали фагом и немедленно переносили в среду, содержащую легкие изотопы (14N и12С).Рибосомы, синтезированные дои после заражения, можно было разделитьцентрифугированием в градиенте плотности, так как их плотности различались(«тяжелые» и «легкие» соответственно;рис. 25.4). Новая РНК была помечена радиоактивными изотопами с помощью 32Ри 14С-урацила, а новый белок был помеченизотопом 35S.
В результате этих экспериментов было установлено следующее.1. Синтеза рибосом после заражения непроисходит, о чем свидетельствует отсутствие «легких» рибосом.2. РНК синтезируется после заражения.Большая часть радиоактивно меченнойРНК обнаруживается в «тяжелом» рибосомном пике.
Итак, большая часть новосинтезированнойРНКассоциированас предсуществующими рибосомами. Дополнительные эксперименты показали, что вовремя роста фага происходит быстрыйраспад и ресинтез этой новой РНК.3. Радиоактивный изотоп 35S временнопоявлялся в «тяжелом» рибосомном пике,из чего следует, что синтез новых белковпроисходит на предсуществующих рибосомах.Эти эксперименты позволили сделать25. Информационная РНКи транскрипция49Рис. 25.4.Центрифугирование рибосоми РНК контрольных бактерийи бактерий, зараженных фагомТ2, в градиенте плотности.
Меченная 32Р РНК, синтезированная после заражения, попадаетв полосу рибосом, образованных до заражения («тяжелые» рибосомы). После заражения синтеза рибосом непроисходит.следующий вывод: рибосомы - неспециализированныеструктуры,синтезирующиев каждый данный момент тот белок, который закодирован в информационной РНК,находящейся в данный момент в рибосомах. Исследования незараженных бактериальных клеток также показали, что информационная РНК служит звеном, переносящим информацию от гена к белку.Вскоре представление об информационнойРНК стало одним из основополагающихв молекулярной биологии.ной ДНК выше температуры плавленияона переходит в одноцепочечную форму.При медленном охлаждении раствора этицепи реассоциируют и образуют двухспиральную структуру, обладающую биологической активностью.
Мармур и Доти обнаружили также, что двухспиральные молекулы образуются только в том случае,если цепи ДНК происходят из организмоводного вида или близкородственных видов. Это наблюдение подсказало Спигелману, что в смеси одноцепочечной ДНКи РНК должны образовываться гибридыДНК-РНК, если их последовательностиоснований комплементарны (рис. 25.5).Схема эксперимента была следующей:1. РНК, синтезированную после заражения Е. coli фагом Т2 (Т2-мРНК), метилиизотопом 32Р. В другом экспериментеДНК фага Т2 (Т2-ДНК) пометили изото3пом Н.2. Смесь Т2-мРНК и Т2-ДНК нагревалидо 100°С. В результате двухспиральнаяДНК расплавлялась и переходила в одноцепочечную форму. Этот раствор, содержащий одноцепочечные РНК и ДНК, медленно охлаждали до комнатной температуры.3. Охлажденную смесь анализировалиметодом центрифугирования в градиентеплотности.
Образцы центрифугировали несколько дней в бакет-роторе. Затем пласти-25.5. Опыты по гибридизации показали,что информационная РНК комплементарнакодирующей ее ДНК-матрицеВ 1961 г. Сол Спигелман (Sol Spigelman)разработал новый метод, названный гибридизацией.
Он должен был дать ответ наследующий вопрос: комплементарна липоследовательность оснований РНК, синтезированной после заражения фагом Т2,последовательности оснований ДНК фагаТ2? Из работы Джулиуса Мармура и ПолаДоти (Julius Marmur, Paul Doty) было известно, что при нагревании двухспираль50Часть IV.ИнформацияРис. 25.5.Если РНК и ДНК имеют комплементарные последовательности, может образоваться гибрид РНК—ДНК.ковые пробирки с образцами протыкалиснизу и собирали фракции по каплям длядальнейшего анализа.В результате были обнаружены три полосы (рис.
25.6). Полоса с наибольшейплотностью соответствовала одноцепочечной РНК. Вторая полоса соответствоваладвухспиральной ДНК. Третья располагалась вблизи от полосы ДНК и состояла издвухцепочечныхгибридныхмолекулДНК—РНК. Итак, Т2-мРНК образовывала гибрид с Т2-ДНК. В отличие от этогоТ2-РНК не гибридизовалась с ДНК многих бактерий и неродственных вирусов, даже если их нуклеотидный состав был подобен Т2-ДНК. Последующие экспериментыпоказали, что фракция мРНК из незараженных клеток гибридизуется с ДНКименно того организма, из которого онабыла выделена, но не с ДНК неродственных организмов.
Эти убедительныеэксперименты продемонстрировали, чтопоследовательность оснований мРНК комплементарна последовательности ДНК-матрицы. К тому же был разработанмощный метод, с помощью которого можно было исследовать поток генетическойинформации в клетках и выяснять, сходныли две молекулы нуклеиновой кислоты.25.6. РибосомныеРНКтакжеДНК-матрицеРис. 25.6.РНК, образовавшаяся послезаражения E. coli фагом Т2,комплементарнавируснойДНК. В этих экспериментах погибридизации РНК метили32Р, а ДНК фага Т2 - 3Н. Распределение радиоактивностив градиенте плотности хлористого цезия показывает, чтобольшая часть РНК, синтезированной после заражения, попадает в одну полосу с ДНКфага Т2. (Spiegelman S., Hybridnucleic acids, Sci.
Amer., 1964.)РНК и транспортныесинтезируютсянаМетод гибридизации был использован затем, чтобы выяснить, синтезируются лирРНК и тРНК также на ДНК-матрицах.Образование гибридов РНК—ДНК выявляли с помощью фильтров, а не центрифугированием в градиенте плотности, так какэтот метод проще, чувствительнее и требует меньше времени. ОдноцепочечныеРНК проходят через нитроцеллюлозныйфильтр, а двухспиральные ДНК и гибридыРНК—ДНК задерживаются на фильтре.РНК Е. coli пометили изотопом 32 Р и смешали с немеченой ДНК Е. coli. Эту смесьнагревали, медленно охлаждали и затемотфильтровывали через нитроцеллюлозу.Радиоактивность, задержанную на фильтре, просчитывали.
Результаты экспериментов не вызывали сомнений: гибридыРНК—ДНКобразовывалисьсовсемирРНК (5S, 16S и 23S) и тРНК. Отсюда следовало, что в геноме Е. coli имеются последовательности, комплементарные этим молекулам РНК.Рис. 25.7.Электронная микрофотография РНК-полимеразы E. coli.(Печатается с любезного разрешения д-ра Robley Williamsи д-ра Michael Chemberlin.)25. Информационная РНКи транскрипция51Рис.
25.8.Механизм реакции элонгациицепи, катализируемой РНК-полимеразой.25.7. Все клеточные РНК синтезируетРНК-полимеразaКонцепция мРНК стимулировала поискифермента, который синтезирует РНК в соответствии с последовательностью ДНКматрицы. Стратегия эксперимента былатакой же, как и при поиске ДНК-полимеразы I. В 1960г. Джерард Хёрвиц и Сэмюэл Вейсс (Jerard Hurwitz, Samuel Weiss)независимо открыли такой фермент.
Ониназвали его РНК-полимеразой. Ферментуиз клеток Е. соli (рис. 25.7) нужны былидля синтеза РНК следующие компоненты.1. Матрица. Предпочтительная матрица - двухцепочечная ДНК. ОдноцепочечнаяДНК также может служить матрицей. НиРНК (как одноцепочечная, так и двухцепочечная), ни гибриды РНК—ДНК не могутслужить эффективными матрицами.2. Активированные предшественники. Необходимы все четыре рибонуклеозидтрифосфата - ATР, GTP, UTP и СТР.3. Двухвалентные ионы металлов. Фермент активен в присутствии Mg 2+ илиMn 2 + . In vivo эту потребность фермента2+удовлетворяет Mg .РНК-полимераза катализирует инициацию и элонгацию цепей РНК.
Фермент катализирует следующую реакцию:(РНК)n остатков + Рибонуклеозидтрифосфат (РНК)n + 1 остаток + PP i .52Часть IV.ИнформацияСинтез РНК во многих отношенияхподобен синтезу ДНК (рис. 25.8). Вопервых, как будет вскоре показано болееподробно, синтез идет в направлении 5'—>—>3'. Во-вторых, по-видимому, механизмэлонгации сходен. Происходит нуклеофильная атака внутреннего фосфата очередного нуклеозидтрифосфата 3'-ОН-группой на конце растущей цепи. В-третьих,движущая сила синтеза - гидролиз пирофосфата.Однако по некоторым важным особенностям синтез РНК отличается от синтезаДНК.
Во-первых, РНК-полимеразе не нужна затравка. Во-вторых, ДНК-матрица присинтезе РНК полностью сохраняется, тогда как при синтезе ДНК она сохраняетсялишь наполовину. В-третьих, РНК-полимераза, насколько известно, не обладает никакими нуклеазными активностями.Все три типа клеточной РНК Е.coli - мРНК, тРНК и рРНК - синтезируются одной РНК-полимеразой в соответствиис инструкциями, заданными ДНК-матрицей. В клетках млекопитающих имеет место разделение труда между несколькимивидами РНК-полимераз.
Кроме того, необходимо отметить, что некоторые вирусыкодируют РНК-синтезирующие ферменты,совершенно отличные от ферментов клетки-хозяина. Таковы, например, РНК-полимераза, кодируемая ДНК-содержащим фагом Т7, и РНК-репликаза, кодируемаяРНК-содержащим фагом Qβ. Репликазафага Qβ является РНК-зависимой РНКполимеразой, так как она синтезируетРНК не по ДНК-матрице, а по РНК(гл. 30).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
