Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Кроме того, сигма-субъединица активирует узнавание промоторных последовательностей РНК-полимеразой. Наконец, сигма-субъединица участвует в раскрывании двойной спиралиДНК, так чтобы одна из цепей могла служить матрицей. При связывании голофермента РНК-полимеразы расплетается примерно один виток спирали ДНК. Такпроисходит подготовка фермента к образованию первой фосфодиэфирной связи новой цепи РНК.После того как начинается синтез новойцепи РНК, сигма-субъединица отделяетсяот голофермента. Кор-фермент продолжает транскрибировать матрицу ДНК. Таким образом, функция голофермента —поиск промотора и инициация, а функциякор-фермента - элонгация.Отделившаясясигма-субъединица присоединяется к другой молекуле кор-полимеразы, чтобы участвовать в инициации нового цикла транскрипции.Инициация новых цепей РНК регулируется многими способами.
Некоторыепромоторные последовательности обеспечивают высокую эффективность инициации, другие менее эффективны. Кроме того, эффективность инициации регулируетсябелками, которые связываются с самимпромоторным участком или рядом с ним.Репрессорыблокируюттранскрипцию,препятствуя связыванию РНК-полимеразы,а факторы положительной регуляции способствуют инициации, облегчая связываниеРНК-полимеразы.
Эти важные регуляторные механизмы мы рассмотрим подробнее в гл. 28.25.13. Цепи РНК начинаются с pppG илирррАБольшинство новосинтезированных цепейРНК содержат своего рода ярлычок, который показывает, с чего начался их синтез. Новые цепи РНК имеют строго определенную структуру 5'-конца: молекуланачинается либо с рррА, либо с pppG. В отличие от синтеза ДНК затравка в этомслучае не нужна. Цепи РНК могут образовываться de novo.Этот ярлычок на 5'-конце был открытдвумя способами.
Было обнаружено, чтоцепи РНК включают 32Р, если инкубационная смесь содержит меченный поγ-атому 32Р-АТР. Очевидно, что включенная метка должна быть локализована наконце, так как только α-атом фосфора нуклеозидтрифосфатаможетучаствоватьв образовании внутренних фосфодиэфирных мостиков РНК. Кроме того, прищелочном гидролизе новосинтезированнойРНК образуются продукты трех типов: нуклеозиды, нуклеозид-2'-монофосфаты (илинуклеозид-3'-монофосфаты) и нуклеозидтетрафосфаты (рис. 25.15).
Если в качестве субстрата использовали γ-32Р-АТР,образовывалсяаденозин-3'-фосфат-5'-трифосфат. γ-Атом фосфора этого нуклеозидтетрафосфата содержал метку. Аналогичный результат был получен с γ-32P-GTP.Однако, если взять γ-меченный СТР илиUTP, радиоактивность не включается.Следовательно,новообразованнаяцепьРНК имеет трифосфатную группу на5'-конце и свободную ОН-группу на 3'-конце.в инкубационную смесь. Таким образом,32Р включается в молекулу РНК в началесинтеза, а не в конце. Следовательно, ростцепи РНК идет в направлении 5 ' — > 3 ' , какпри синтезе ДНК.Кор РНК-полимеразы движется вдольцепи матричной ДНК в направлении 3'—>—>5', так как матричная цепь антипараллельна новосинтезированной цепи ДНК.Одна и та же молекула РНК-полимеразысинтезирует весь транскрипт - иными словами, транскрипция процессивна.
По меретого как расплетается очередной участокДНК, транскрибированный участок восстанавливает свою двухспиральную конформацию. Максимальная скорость элонгациисоставляетпримерно50нуклеотидовв секунду.Необходимо подчеркнуть, что РНК-полимераза не обладает нуклеазной актив-25.14. Цепи РНК синтезируютсяв направлении 5'—>3'В каком направлении синтезируется РНК?В направлении 5'—>3' или 3'—>5'? Двапротивоположных механизма роста цепипроиллюстрированы на рис. 25.16. При росте в направлении 5'—>3' трифосфатныйконец образуется в начале роста цепи,а при росте 3'—>5' трифосфатный конецпоявляется с последним включеннымостатком. Кинетика включения радиоактивности в РНК, синтезированную изγ-32P-GTP (или АТР), указывает, какая изэтих возможностей имеет место.
Если в качестве субстрата использовать γ-32P-GTP,то отношение включения 32 Р к общемувключению нуклеотидов в продукт достигает максимума очень быстро после смешивания компонентов, а затем постепенноснижается во времени. При этом общая радиоактивность уже помеченной РНК неснижается при последующем добавлениибольшого избытка нерадиоактивного GTPРис.
25.15.Продукты щелочного гидролиза цепи РНК, меченной с помощью γ-32Р-АТР.25. Информационная РНКи транскрипция57Рис. 25.16.ПредполагаемоеположениеР-метки в случае роста в направлении 5'—>3' и 3'—>5'. Наблюдаемое в действительностиположение метки показывает,что РНК синтезируется в направлении 5'—>3'.32ностью.
В отличие от ДНК-полимеразыРНК-полимераза не проверяет правильности новообразованной полинуклеотиднойцепи. В связи с этим надежность транскрипции значительно ниже, чем надежность репликации. Частота ошибок присинтезе РНК составляет примерно однуошибку на 10 4 —10 5 нуклеотидов, что в 105раз выше, чем при синтезе ДНК. Гораздоболее низкую надежность синтеза РНКклетка обходит тем, что с одного гена синтезируется много копий РНК-транскриптов.25.15. Матричная ДНК содержит стоп-сигналы для транскрипцииТерминирование транскрипции регулируется так же тонко, как и инициирование.В матричной ДНК имеются стоп-сигналы,которые были расшифрованы путем сравнения различных последовательностей оснований в этих участках.
Все они имеютодну общую особенность: вслед за GC-богатой областью перед участком терминации располагается АТ-богатая последовательность. Отличительная особенностьтерминирующихпоследовательностей —симметрия второго порядка этой GC-бога58Часть IV.Информациятой области (рис.
25.17). Следовательно,РНК-транскрипт этой области самокомплементарен, а это значит, что он способенк спариванию оснований, приводящемукобразованиюструктурышпильки(рис. 25.18). Кроме того, новообразованныецепи РНК кончаются несколькими остатками U, которые кодируются серией оснований А в АТ-богатой области ДНК-матрицы. Одна или несколько подобныхструктурныхособенностейзаставляютРНК-полимеразу задержаться, сделатьпаузу, когда она сталкивается с таким сигналом. В некоторых участках терминацииновообразованные цепи РНК высвобождаются без участия дополнительных белков. В других местах для терминации цепинеобходимо участие белка ρ (ро).25.16.
Белок ρ участвует в терминированиитранскрипцииТот факт, что терминирование транскрипции в некоторых участках происходитс участием белка ρ, подтверждается следующими данными: молекулы РНК, синтезированные in vitro в присутствии белкаρ, короче молекул, полученных в его отсутствие.
Например, РНК, синтезированная наДНК фага fd в присутствии белка ρ, имееткоэффициент седиментации 10S, тогда какРНК, синтезированная в отсутствие белка ρ,- 23S. Дополнительные сведения о действии белка ρ были получены при добавлении этого фактора терминации в инкубационную смесь через различные промежутки времени после начала синтеза РНК.Если белок ρ добавляли через несколькосекунд, через 2 и 10 мин после инициации,получали РНК с коэффициентами седиментации 13, 17 и 23S соответственно. Этот ре-терминации, не требующий белка ρ (дает23S-PHK). Следовательно, специфическаятерминация может происходить и в отсутствие белка ρ.
Однако белок ρ выявляетдополнительные сигналы терминации, которые сама по себе РНК-полимераза узнавать не может.Каким образом белок ρ вызывает терминацию синтеза РНК по достижении определенных сигналов терминации? Одна извозможностей состоит в том, что этот белок-тетрамер с массой 200 кДа - садитсяна РНК и движется по направлению к молекуле РНК-полимеразы, останавливая еена участке терминации. Согласно этой модели, белок ρ вытесняет РНК-полимеразус 3'-конца РНК, что приводит к высвобождению РНК-транскрипта. Интересно отметить, что при терминировании транскрипции белок ρ гидролизует АТР.Как можно было предвидеть, терминирование транскрипции некоторых геновконтролируется.
В ходе дальнейшего изложения мы увидим, что бактериофаг λ синтезирует белки-антитерминаторы, обеспечивающиевозможностьтранскрипциии экспрессии некоторых генов (разд. 28.11),У Е. coli действует система регуляции с использованием специализированных терминирующих сигналов, называемых аттенюаторами, для обеспечения пищевых потребностей клетки (разд. 28.9).Рис. 25.17.ПоследовательностьДНК,соответствующая3'-концуtrp-мРНК E.coli.
Последовательности оснований, показанные желтым цветом, обладают симметрией второго порядка относительно оси, обозначенной зеленым цветом.зультат свидетельствует о том, что матрица содержит но крайней мере три участкатерминации, чувствительных к белку ρ (онидают 10S-, 13S- и 17S-PHK), и один участокРис. 25.18.Последовательностьоснований 3'-конца мРНК, транскрибированной с триптофановогооперона E.coli. Возможно образование стабильной структурышпильки.25. Информационная РНКи транскрипция59Рис. 25.19.Влияние фактора ρ на размертранскрибируемых РНК.25.17.
Многие молекулы РНКпосле транскрипции расщепляютсяи химически модифицируютсяОбразование функционально активных молекул РНК (процессинг) продолжается после завершения транскрипции. У прокариотмолекулы транспортных и рибосомныхРНК образуются путем расщепления и химической модификации определенных новосинтезированных цепей РНК. Например,у E.coli три вида молекул рибосомныхРНК и одна молекула транспортной РНКвырезаются из первичного РНК-транскрипта, который, кроме того, содержитспейсерные (разграничивающие) участки(рис. 25.20). Другие транскрипты содержатпо несколько различных видов тРНК илинесколько копий одной и той же тРНК.Нуклеазы, которые расщепляют и укорачивают эти предшественники рРНК и тPHK,действуют с высокой точностью.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
