Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Поскольку тамРНК, которая уже имелась в смеси ковремени добавления дезоксирибонуклеазы,лабильна, синтез белка можно прекратитьв течение нескольких минут. Затем Ниренберг обнаружил, что синтез белка возобновляется при добавлении неочищеннойфракции мРНК. Таким образом, в руках70Часть IV.ИнформацияНиренберга была бесклеточная системасинтеза белка, зависящая от добавлениямРНК.Другим важнейшим компонентом в этомэксперименте был синтетический полирибонуклеотид poly(U). Poly(U) синтезировали с помощью полинуклеотид-фосфорилазы - фермента, открытого в 1955 г. Марианной Грюнберг-Манаго и Северо Очоа(Marianne Grunberg-Manago, Severo Ochoa).Этот фермент катализирует синтез полирибонуклеотидов из рибонуклеозиддифосфатов:(РНК) n + Рибонуклеозиддифосфат(РНК) n + 1 + Pi.Полинуклеотид-фосфорилаза и РНК-полимераза катализируют совершенно различные реакции.
В приведенной реакцииактивированными предшественниками служат рибонуклеозиддифосфаты, а не трифосфаты. Продукт реакции - ортофосфат,а не пирофосфат. Следовательно, равновесие в реакции не может быть сдвинутовправо в результате гидролиза пирофосфата. В самом деле, in vivo равновесие сдвинуто в сторону распада РНК, а не ее синтеза. Принципиальное отличие состоитв том, что полинуклеотид-фосфорилаза неиспользует матрицы. Состав РНК, синтезированной этим ферментом, определяетсясоотношением рибонуклеотидов в инкубационной смеси, а последовательность близка к случайной.
Благодаря этому полинуклеотид-фосфорилаза оказалась ценнейшим инструментом в экспериментах порасшифровке генетического кода. Например, poly(U) синтезировали, инкубируяв присутствии фермента раствор высокойРис. 26.3.Синтез белка в бесклеточнойсистеме останавливается черезнесколько минут после добавления дезоксирибонуклеазыи возобновляется при добавлении мРНК.концентрации UDP. Сополимеры двух рибонуклеотидов, например U и А, со случайной последовательностью готовили,также инкубируя UDP и АТР с этимферментом.Различные синтетические рибонуклеотиды вводили в бесклеточную систему синтеза белка и измеряли включение меченного 14С L-фенилаланина.
Результаты оказались поразительными:ДобавленныйполинуклеотидКонтрольPoly(A)Poly(С)Poly(U)14С, имп./мин44503839800Тот же эксперимент был проделанс различными 14С-аминокислотами в каждой инкубационной смеси. Оказалось, чтоpoly(А)вызываетсинтезполилизина,a poly(С) - синтез полипролина. Так былорасшифровано три кодовых слова:Кодовое словоАминокислотаUUUАААСССФенилаланинЛизинПролинКодовое слово GGG невозможно былорасшифровать таким же образом, потомучто poly (G) не работает в качестве матрицы. Возможно, это объясняется тем,что он образует трехцепочечную спиральнуюструктуру.Полирибонуклеотиды,образующие протяженные участки с упорядоченной структурой, не эффективны в качестве матриц для синтеза белка.26.4. Состав кодонов многих аминокислотбыл определен с помощью сополимеровв качестве матрицДля дальнейшего изучения генетическогокода были использованы в качестве матриц полирибонуклеотиды, состоящие изоснований двух типов.
Например, случайный сополимер U и G содержит восемьТаблица 26.1. Ожидаемая встречаемость триплетовв случайном сополимере U (0,76) и G (0,24)ТриплетВероятностьОтносительнаявстречаемость, %UUUUUGUGUGUUUGGGUGGGUGGG0,76•0,76•0,76=0,4390,75•0,24•0,24 = 0,1390,76•0,24•0,76 = 0,1390,24•0,76•0,76 = 0,1390,76•0,24•0,24 = 0,04380,24•0,76•0,24 = 0,04380,24•0,24•0,76 = 0,04380,24•0,24•0,24 = 0,013810031,631,631,610,010,010,03,1различных триплетов: UUU, UUG, UGU,GUU, UGG, GUG, GGU и GGG.
Относительную частоту этих триплетов можнолегко вычислить, исходя из молярного соотношения U и G в сополимере. Оно составляло 0,76:0,24 (табл. 26.1). Относительное включение различных аминокислот в присутствии этой матрицы приведено в табл. 26.2. В наибольшей степенивключался, как и можно было предполагать, фенилаланин, так как триплет UUUвстречался чаще всего. Затем шли валин,лейцин и цистеин. Уровень их включениясоставлял чуть больше трети от включенияфенилаланина, что соответствует вычисленной частоте встречаемости триплетов,содержащих два U и одно G. Включениедругих аминокислот было очень низким.Отсюда был сделан вывод, что валин, лейцин и цистеин кодируются кодонами, содерТаблица 26.2. Включение аминокислот в присутствиислучайного сополимера U (0,76) и G (0,24)АминокислотаФенилаланинВалинЛейцинЦистеинТриптофанГлицинние, %Состав соответствующегокодона1003736351412UUU2U, 1G2U, 1G2U, 1G1U, 2G1U, 2GОтносительное включе-26.
Генетический код.Зависимость гены-белки71жащими 2U и 1G, а триптофан и глицинкодируются кодонами, которые содержат1U и 2G.Эксперименты того же типа проводилии с другими случайными сополимерами,а именно с UA, UC, АС и AG, а такжес UGC, AGC, UAC и UAG. Таким образомв лабораториях Ниренберга и Очоа былопределен состав кодонов, соответствующих каждой из 20 аминокислот.26.5. Тринуклеотиды способствуютсвязыванию определенных молекул тРНКс рибосомамиПри использовании смешанных сополимеров в качестве матриц удалось установитьсостав кодонов, соответствующих определенным аминокислотам, но не их последовательность (кроме UUU, ААА и ССС).Как уже говорилось, валин кодируетсятриплетом из 2U и 1G.
Какой же это триплет: UUG, UGU или GUU? Ответ наэтот вопрос был получен с помощью двухсовершенно различных экспериментальныхподходов: во-первых, с использованиемсинтетических полирибонуклеотидов с упорядоченной последовательностью и, вовторых, с помощью зависимого от кодонаспецифического связывания молекул тРНКс рибосомами.В 1964 г. Ниренберг установил, что тринуклеотидыспособствуютсвязываниюопределенных молекул тРНК с рибосомамив отсутствие синтеза белка.
Например, добавление pUpUpU вызывает связываниефенилаланиновой тРНК, а рАрАрА значительно увеличивает связывание лизиновойтРНК, как и рСрСрС - связывание пролиновой тРНК. Динуклеотиды не стимулируют связывания тРНК с рибосомами. Этиработы показали, что тринуклеотид (каки триплет в мРНК) специфически связывается с определенной молекулой тРНК,для которой он является кодовым словом.Был разработан простой и быстрый тестна связывание: связанные с рибосомамимолекулы тРНК задерживаются на нитроцеллюлозном фильтре, а несвязанные молекулы тРНК проходят через фильтр.
Длятого чтобы определить, какие именно молекулы тРНК садятся на фильтр, использовали молекулы тРНК, несущие определенную аминокислоту, меченную 14С.72С помощью методов органической химии и биохимии были синтезированы все64 тринулеотида. Для каждого тринуклеотида было проверено связывание молекултРНК, соответствующих всем 20 аминокислотам. Например, было показано, чтоpUpUpG стимулирует связывание тольколейциновой тРНК, pUpGpU - только цистеиновой тРНК, a pGpUpU - связываниетолько валиновой тРНК. Отсюда был сделан вывод, что кодоны UUG, UGUи GUU соответствуют лейцину, цистеинуи валину соответственно.
С несколькимикодонами не было получено избирательного связывания какой-либо тРНК, тогда какс несколькими другими связывалось болееодной тРНК. Для большинства кодоновбыли получены вполне четкие результаты.В общем этот простой и элегантный подход позволил расшифровать около 50 кодонов.26.6. Еще один инструмент расшифровкикода - сополимеры с определеннойпоследовательностьюПримерно в то же время Гобинду Коране(Gobind Khorana) удалось синтезироватьполирибонуклеотиды с определенной повторяющейся последовательностью. Сочетая методы органической химии и ферментативные методы, он синтезировал рядсополимеров с повторяющейся последовательностью из двух, трех и четырех оснований.
Рассмотрим, к примеру, стратегиюсинтеза poly(GUA). Этот упорядоченныйсополимер имеет последовательностьGUAGUAGUAGUAGUAGUAGUAGUA...Прежде всего Корана синтезировал с помощью методов органической химии двакомплементарных дезоксирибонуклеотидапо девять нуклеотидов длиной: d(TAC)3 иd(GTA) 3 . Затем эти два олигонуклеотидабыли использованы в качестве матрицыдля синтеза длинных цепей ДНК из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов под действием ДНК-полимеразы I. Ни один олигонуклеотид в отдельности не был эффективной матрицей. Если же присутствовалиоба олигонуклеотида, то d(TAC)3 служилматрицей для синтеза poly(dGTA), ad(GTA) 3 - для синтеза poly(dTAC). Этидлинные комплементарные ДНК образовывали двухспиральные молекулы. Следующим шагом было получение длинныхсодержит кодоны двух видов - АБА и БАБ.Поэтому полипептидный продукт долженпредставлять собой чередующуюся последовательность из двух аминокислот (сокращенно обозначенных ак1 и ак 2 ):Стоит ли на N-конце полипептидного продукта aк1 или ак2, зависит от того, начинается ли рамка считывания с А или с Б.Если в качестве матрицы использовалиpoly(UG), то синтезировался полипептидиз чередующихся валина (Val) и цистеина(Суs):UGU|GUG|UGU|GUG|UGU|GUGРис.
26.4.Цепь этой двухспиральной матричной ДНК, которая должнатранскрибироваться,определяется набором рибонуклеозидтрифосфатов в инкубационной смеси.полирибонуклеотидных цепей с последовательностью, соответствующей poly (dTAC)иpoly(dGTA).Дляэтогодуплексpoly(dTAC): poly(dGTA) использовалив качестве матрицы для РНК-полимеразы.Цепь ДНК для транскрипции можно выбрать, добавляя три подходящих рибонуклеозидтрифосфата. Если в инкубационную смесь добавить GTP, UTP и АТР, гона матричной цепи poly(dTAC) синтезируется полирибонуклеотидный продуктpoly(GUA). Другая цепь не транскрибируется, так как не хватает одного из необходимых субстратов - СТР. Если же добавить СТР, UTP и АТР, то на другойматричной цепи синтезируется poly(UAC).Итак, органический синтез и вслед за нимматричный синтез с помощью ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы позволили синтезировать два длинных полирибонуклеотида со строго определенной повторяющейсяпоследовательностью оснований (рис.
26.4).Эти регулярные сополимеры были использованы в качестве матриц в бесклеточной системе синтеза белка. Рассмотрим некоторые результаты такого эксперимента.Сополимер, состоящий из чередующейсяпоследовательности двух оснований - Аи Б:АБА | БАБ | АБА | БАБ | АБА |. . .Этот результат однозначно доказывал триплетность кода и показывал, что один изтриплетов - UGU или GUG - кодирует цистеин, а другой - валин. В сочетаниис данными по связыванию тРНК былоочевидно, что UGU кодирует цистеин,a GUG - валин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
