Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Клеточные же ферменты, синтези-5'-GCGGCGACGCGCAGUUAAUCCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-3'3'-CGCCGCTGCGCGTCAATTAGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAA-5'5'-GCGGCGACGCGCAGTTAATCCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTT-3'Рис. 25.9.Последовательность оснований мРНК комплементарнапоследовательности матричной ДНК. Показана часть последовательности триптофанового оперона.рующие РНК, наоборот, представляют собой ДНК-зависимые РНК-полимеразы.25.8. РНК-полимераза получает инструкцииот ДНК-матрицыПодобно ДНК-полимеразам, описаннымв предыдущей главе, РНК-полимераза используетинформацию,содержащуюсяв ДНК-матрице. Первым доводом в пользу этого утверждения послужили данныео том, что нуклеотидный состав новосинтезированной РНК комплементарен составу матричной цепи ДНК.
Если в качествематрицы использовать синтетический полидезоксирибонуклеотид poly(dT), содержащий только остатки тимидиловой кислоты,то в синтезируемую полирибонуклеотидную цепь включается только один рибонуклеозидтрифосфат - АТР. Продукт реакции - полирибоаденилат [сокращенное обозначение poly(rA)].
Если в качестве матрицы для РНК-полимеразы используетсясополимер с чередующимися основаниямиpoly(dA-dT), то включаются UTP и АТР,а в качестве продукта реакции образуетсяpoly(rA-rU). Нуклеотидный состав РНК,синтезированной с использованием в качестве матрицы одноцепочечной ДНК фагаφХ174, также свидетельствует о наличиикомплементарности между РНК-продуктом и ДНК-матрицей (табл. 25.2).
Эксперименты по гибридизации показывают, чтоРНК, синтезированная РНК-полимеразой,Таблица 25.2. Нуклеотидный состав РНК, синтезированной на вирусной ДНК в качестве матрицыДНК-матрица (плюс-цепь фагаφХ174)АТGС0.250,330,240,18РНК-продукт0,250,320,230,20UАСGмРНКДНКкомплементарна матричной ДНК. Наиболее убедительный довод в пользу надежности копирования ДНК при транскрипцииполучен при изучении последовательностиоснований; оказалось, что последовательность мРНК в точности комплементарнапоследовательностиматричнойДНК(рис.
25.9).25.9. Обычно в данном участке геноматранскрибируется только одна цепь ДНКТранскрибируются ли обе цепи двухспиральной матричной ДНК, или только одна? А priori кажется маловероятным, чтов одном и том же участке ДНК обе цепикодируют функциональные белки. Один изпервых ответов на этот вопрос был получен при использовании метода гибридизации в опытах с Е. coli, зараженной фагомφХ174.
Частицы фага φХ174 содержатодноцепочечную ДНК, которую называютРис. 25.10.Как показывает этот гибридизационный эксперимент, только одна цепь РФ-ДНК фагаφХ174 используется в качествематрицы при транскрипции.25. Информационная РНКи транскрипция53Рис. 25.11.Электронная микрофотография, на которой виден процесстранскрипции.[Miller О. L.,Hamkalo В. A., Visualization ofRNA synthesis on chromosomes,Int. Rev. Cytol., 33, 1 (1972).]плюс-цепью. После того как плюс-цепьпроникает в бактерию, синтезируется комплементарная минус-цепь, и в результатеобразуется кольцевая двухцепочечная молекула ДНК, называемая репликативнойформой (РФ).
Эта РФ-ДНК направляетсинтез мРНК, которая в свою очередь детерминирует фаговые белки. Вскоре послезаряжения E. coli фагом φХ174 в среду добавляли 32Р-фосфат; так получили радиоактивную фаговую РНК. Ее выделили.Кроме того, РФ-ДНК разделили на составляющие плюс- и минус-цепи, что нетрудно сделать, поскольку они различаются понуклеотидному составу и, следовательно,по плавучей плотности. Затем осуществилигибридизацию, с тем чтобы выяснить, комплементарналиновосинтезированнаямРНК плюс-цепи, или минус-цепи, или жеобеим цепям.
Был получен однозначныйрезультат: только минус-цепь РФ-ДНКобразовывала гибрид с меченой мРНК.Итак, только одна цепь РФ-ДНК фага54Часть IV.ИнформацияφХ174 служит in vivo матрицей для транскрипции.Точно так же только одна цепь таких вирусов, как Т7, SP8 и α, транскрибируется invivo. В случае таких вирусов, как фаги Т4или λ, ситуация сложнее. В одних участкахгенома матрицей служит одна цепь, в других - другая. Такая же транскрипция с переменой матрицы в различных группах геновпроисходит и в клетках Е.
coli.25.10. РНК-полимераза Е. coli состоит изсубъединицРНК-полимераза Е. coli - очень большойи сложный фермент. Масса целого фермента равна примерно 500 кДа. РНК-полимераза состоит из отдельных субъединиц(табл. 25.3); это можно доказать, вызвавдиссоциацию фермента в концентрированном растворе мочевины. Субъединичныйсостав целого фермента, называемого голоферментом,- α2ββ'σ.
Как это видно изТаблица 25.3. Субъединицы РНК-полимеразы E.coliОбозначениесубъединицыЧислосубъединицМасса, кДаαβ21114015516595β'σ.Рис. 25.12.Электронная микрофотография РНК-полимеразы-голофермента, связанного со многими промоторными участками фрагмента ДНК фага Т7.[Williams R.C., Ргос. Nat. Acad.Sci., 74, 2313 (1977).]последующего текста, после того как инициация синтеза РНК произошла, σ-субъединица отделяется от фермента. РНК-полимераза без σ-субъединицы называетсяминимальным ферментом или кор-ферментом (α2ββ').
Каталитический участок РНКполимеразы находится в кор-ферменте.Установлено, что β'-субъединица участвуетв связывании с ДНК-матрицей, а β-субъединица - в связывании субстратов - рибонуклеозидтрифосфатов. σ-Субъединица голофермента участвует в выборе участкаинициации транскрипции.Синтез РНК РНК-полимеразой Е. coliпроисходит в три этапа, называемых1) инициация, 2) элонгация и 3) терминация. С этими процессами мы познакомимся несколько ниже.25.11.
Транскрипция инициируется на промоторных участках матричной ДНКТранскрипция начинается в определенныхучастках матричной ДНК, называемыхпромоторами. Как РНК-полимераза находит эти участки? Один из подходов к решению этой проблемы состоит в том,чтобы выделить те фрагменты, которыеголофермент РНК-полимеразы защищаетот расщепления панкреатической дезокси-рибонуклеазой, и определить в этих фрагментах последовательность нуклеотидов.Другой подход сводится к тому, чтобы исследовать ряд мутантов с повышенной илипониженной интенсивностью транскрипцииопределенных генов.
В результате такихисследований было установлено, что промоторные участки состоят примерно из сорока пар оснований, что соответствуетфрагменту ДНК длиной примерно 140 А.Как показал анализ различных промоторов Е. coli и фагов, функцию сигнала узнавания в основном выполняет последовательность семи пар оснований, серединакоторой находится на расстоянии примерно 10 нуклеотидов перед точкой, с которойначинается кодирование мРНК (рис. 25.13).Второй участок узнавания расположен нарасстоянии около 35 нуклеотидов передточкой начала мРНК; он также участвуетв первоначальном связывании РНК-полимеразы.25.12. σ-Субъединица обеспечиваетузнавание промоторных участков РНКполимеразойКор-фермент (α2ββ') РНК-полимеразы неможет начинать транскрипцию в промоторных участках. Для специфической инициациинеобходимголофермент α2ββ'σРоль сигма-субъединицы была открытаследующим образом.
Если РНК-полимеразу очищали хроматографией на колонкес фосфоцеллюлозой, то она была практи-Рис. 25.13.Промоторные последовательности лактозного (А), галактозного (Б) и триптофанового (В)оперонов E.coli, фагов λ (Г)и φХ174 (Д) и вируса SV-40 (Е).Предполагаемая область гомологии, так называемая последовательностьПрибнова(Pribnow), показана зеленым.25. Информационная РНКи транскрипция55Рис.
25.14.Разделение РНК-полимеразына σ-субъединицу и кор-фермент (минимальный фермент;α2ββ')на колонке с фосфоцеллюлозой.чески лишена активности при использовании в качестве матрицы ДНК фага Т4, носохраняла активность в опытах с ДНК изтимуса теленка. Наряду с этим та же РНКполимераза, очищенная центрифугированием в градиенте концентрации глицерола,была, напротив, весьма активна на обеихматрицах.
Из этого наблюдения можнобыло сделать вывод, что в препарате РНКполимеразы, очищенной на фосфоцеллюлозе, не хватает какого-то фактора. Так онои было (рис. 25.14). Активность фермента,очищенного на фосфоцеллюлозе, значительно увеличивается при добавлении другой фракции, элюирующейся с колонки.Этот стимулирующий фактор сам по себене обладает каталитической активностью.Он был назван сигма (σ)-фактором. Последующие эксперименты показали, что фермент, очищенный на фосфоцеллюлозе,лишен σ-субъединицы, тогда как фермент,очищенный в глицероле, содержит ее. Таким образом, препарат, проявлявший максимальную активность при использованиив качестве матрицы ДНК фага Т4, представлял собой голофермент α2ββ'σ а кор-фермент α2ββ' был не в состоянии транскрибировать эту ДНК.
Добавление σ-субъединицы к кор-ферменту приводило к реконструкции вполне активного голофермента.Кор-фермент обладал способностью транскрибировать ДНК тимуса теленка, таккак эта матрица содержит много одноцепочечных разрывов. РНК, синтезированнаякор-полимеразой in vitro, не соответствуеттранскриптам, образующимся in vivo.В частности, кор-фермент транскрибирует56Часть IV.Информацияобе цепи фаговых ДНК-матриц, тогда какголофермент транскрибирует асимметрично одну цепь, как он это делает in vivo.Сигма-субъединица обеспечивает специ4фическую инициацию, снижая в 10 разсродство РНК-полимеразы к ДНК, несодержащей промоторов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
