Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 5
Текст из файла (страница 5)
(Печатается с любезного разрешенияд-ра David Clayton.)24.12. Открытие ДНК-полимеразыПерейдем теперь к молекулярному механизму репликации ДНК. Артур Корнберг(Arthur Kornberg) и его коллеги в 1955 г.начали поиск фермента, синтезирующегоДНК. Вскоре этот поиск увенчался успехом, главным образом потому, что припланировании экспериментов были приняты три правильных решения, т.е.
былсделан правильный выбор между несколькими возможностями.1. Что представляют собой активированные предшественники ДНК? Корнберги его коллеги сделали правильное предположение, что активированные промежуточные продукты синтеза ДНК - дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты. В основе это24. ДНК: генетическая роль,структура и репликация21Рис. 24.24.Фотографии гелей, на которыхвидна релаксация суперспирализованной ДНК вируса SV-40.Дорожка А - суперспирализованная ДНК с большим числом отрицательных витков.При инкубации ДНК с топоизомеразой в течение 5 мин (Б)и 30 мин (В) образуется ряд полос с более низкой степенью суперспирализации.
[Keller W.,Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 2553(1975).]го предположения лежали два соображения. Во-первых, пути биосинтеза пуринови пиримидинов приводят к образованиюнуклеозид-5'-фосфатов (а не нуклеозид-3'фосфатов). Во-вторых, активированнымпромежуточным продуктом синтеза пирофосфатной связи в таких коферментах, какNAD + , FAD и СоА, является АТР.2. Что может служить критерием синтеза Д Н К ? Предполагалось, что абсолютноеколичество ДНК, синтезированной в первоначальных экспериментах, должно бытьвесьма невелико, главным образом из-заобилия нуклеаз.
Поэтому нужен был какой-то чувствительный тест. Был разработан такой тест с использованием радиоактивныхнуклеотидов-предшественников.Включение этих предшественников в ДНКобнаруживали путем измерения радиоак22Часть IV.Информациятивности в осадке, полученном после обработки инкубационной смеси кислотой. В основе этого метода лежит тот факт, чтоДНК осаждается кислотами, напримертрихлоруксусной кислотой, а нуклеотидыпредшественники остаются в растворе.3. Какие клетки следует выбрать для исследования? После того как первоначальные эксперименты с экстрактами животных клеток дали отрицательные результаты, выбор пал на бактерии Е.
coli,поскольку деление этих клеток происходитвсего лишь за 20 мин (время генерации), и,следовательно, их можно выращиватьв больших количествах. Как и предполагалось, эта бактерия исключительно богатаферментами, участвующими в синтезеДНК.Экстракт Е. coli инкубировали с радиоактивнымдезокситимидин-5'-трифосфатом.14РадиоактивностьэтогоС-меченногопредшественника составляла 1•106 имп./мин.
Радиоактивность осадка, полученногодобавлением к инкубационной смеси кислоты, составляла всего 50 имп./мин. Былосинтезировано лишь несколько пикомолейДНК, но этим было положено начало.Корнберг писал: «Хотя количество нуклеотида, включившегося в состав нуклеиновойкислоты, было ничтожным, оно было существенно выше уровня фона. Мы попробовали забить клин в эту узенькую щелку.Рис. 24.25.Электронная микрофотография молекул ДНК-полимеразы (сферические структуры),связанных с молекулой ДНК(тонкая нить). (Печатаетсяс любезного разрешения д-раJack Griffith.)Рис. 24.26.Реакция элонгации цепи, катализируемая ДНК-полимеразой.Молотком нам служила очистка фермента - метод, отработанный при изученииспиртового брожения».Этот новый фермент был назван ДНКполимеразой (рис.
24.25). Теперь его называют ДНК-полимеразои I, так как с техпор были выделены другие ДНК-полимеразы. После десяти лет напряженной работы в лаборатории Корнберга ДНК-полимераза I была очищена до гомогенногосостояния и детально охарактеризована.Насколько велики были масштабы проделанной работы, говорит тот факт, что дляполучения 500 мг чистого фермента необходимо было взять 100 кг клеток E.coli.ДНК-полимераза I - это единая полипептидная цепь с массой 109 кДа.
Она катализирует последовательное присоединение дезоксирибонуклеиновых звеньев к цепи ДНК:(ДНК)nостатков+ dNTP+(ДНК)n+1+ РРiДля синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразеI необходимы следующие компоненты:1. В среде должны присутствовать всечетыре дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфата: dATP, dGTP, dTTP и dCTP. В дальнейшем мы будем обозначать эти дезоксирибонуклеозидтрифосфаты общим символомdNTP. Кроме того, необходимы ионыМg2+.2.
ДНК-полимераза I присоединяет де-зоксирибонуклеотиды к 3'-гидроксильномуконцу предсуществующей цепи ДНК (илиРНК). Другими словами, необходима затравочная цепь, или затравка, со свободной 3'-гидроксильной группой.3. Необходима матричная ДНК. Матрицей может служить как одно- так и двухцепочечная ДНК. Двухцепочечная ДНК служит эффективной матрицей лишь в томслучае, если ее сахарофосфатный остовразорван в одном или нескольких местах.Реакция элонгации (удлинения) цепи, катализируемая ДНК-полимеразой, происходит путем нуклеофильной атаки 3'-ОН-концом матрицы ближайшего к рибозе атомафосфора очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата.
В результате образуется фосфодиэфирный мостик и одновременно высвобождается пирофосфат (рис. 24.26). Последующий гидролиз пирофосфата обеспечивает дальнейшую полимеризацию. Такоесмещение общего состояния равновесиябыло бы невозможно, если бы активированными промежуточными продуктамислужили нуклеозиддифосфаты. Именнов этом мы усматриваем убедительнуюпричину преобладания нуклеозидтрифосфатов по сравнению с дифосфатами в качестве активированных предшественниковв биосинтетических реакциях.
Элонгацияцепи ДНК происходит в направлении 5'—>—>3' (рис. 24.27). За секунду одна молекулаДНК-полимеразы I присоединяет примерно 10 нуклеотидов. Полимеризация процес24. ДНК: генетическая роль,структура и репликация23Рис. 24.27.ДНК-полимеразыкатализируют рост цепей ДНК в направлении 5'—>3'.сивна, т.
е. фермент присоединяет много нуклеотидов, оставаясь связанным с однойматрицей.24.13. ДНК-полимераза получаетинструкции от матрицыДНК-лолимераза катализирует образование фосфодиэфирной связи только в томслучае, если основание очередного нуклеотида комплементарно соответствующемуоснованию матричной цепи. Если же основание очередного нуклеотида не образуетуотсон-криковской пары с соответствующим основанием матричной цепи, вероятность образования ковалентной связиочень низка. Следовательно, ДНК-полимераза - фермент, направляемый матрицей.Она была открыта первой из ферментовтакого типа.Ряд экспериментов доказывает, что ДНКполимераза получает инструкции от матрицы.1. Первым доводом в пользу этого утверждения послужил тот факт, что значительный синтез ДНК идет только в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и матричной Д Н К ,2.
ДНК-полимеразаможетвключатьв ДНК некоторые аналоги оснований. Например, урацил или 5-бромурацил можетзамещать тимин. Гипоксантин может замещать гуанин. Способность аналогов замещать основания высоко специфична. Согласно правилу замещения, тот или инойаналог может включаться лишь при условии, что он способен образовать уотсонкриковскую пару с основанием, комплементарным замещаемому основанию. Так, гипоксантин может замещать G (но не А, Т24Часть IV.Информацияи С), поскольку он образует подходящуюпару оснований с цитозином.3. Нуклеотидный состав новосинтезированной ДНК зависит от характера матрицы, а не от относительного количествачетырехнуклеотидов-предшественников.Образующаяся ДНК имеет тот же нуклеотидный состав, что и двухспиральная матричная ДНК. Из этого следует, что поддействием ДНК-полимеразы реплицируются обе цепи матричной ДНК.4.
Наиболее убедительным доводом служат данные о том, что ДНК фага φХ174,реплицированная in vitro ДНК-полимеразой I, полностью инфекционна. Следовательно, частота, с которой этот ферментделает ошибки, очень низка.24.14. ДНК-полимераза I исправляетошибки в ДНКДНК-полимераза обладает еще одним видом ферментативной активности: в определенных условиях она способна расщеплятьцепи ДНК.
ДНК-полимераза постепенногидролизует цепь ДНК с 3'-гидроксильного конца. При этом отщепляются мононуклеотиды. Таким образом, ДНК-полимераза I является также 3'—>5'-экзонуклеазой(рис. 24.28). Удаляемый нуклеотид должениметь свободный 3'-ОН-конец и не долженнаходиться в составе двойной спирали.Является ли такая экзонуклеазная активность фермента нежелательным побочнымэффектом, или она каким-то образом участвует в биологическом действии ДНК-полимеразы? Эксперименты с использованием химически синтезированных полинуклеотидов с некомплементарным остаткомна конце затравки показали, что 3'—>—>5'-экзонуклеазная активностьвыполняет в процессе полимеризации функцию редактирования.
Рассмотрим полимер, показанный на рис. 24.28, в котором последовательность остатков dT образует двойнуюспираль с более длинным полимером dA.На 3'-конце этой poly(dT)-последовательности имеется один остаток dC, которыйне образует водородных связей, так как онне комплементарен dA. При добавленииДНК-полимеразы и dTTP этот некомплементарный остаток dC отщепляется раньше, чем начинается присоединение остатков dT.
Эксперименты с использованиеммножества различных синтетических полимеров показали, чтоДНК-полимеразаI всегда удаляетнекомплементарныеостатки на конце затравки, прежде чемпродолжать полимеризацию. Если на конценаходится комплементарное основание ив среде присутствуют активированныепредшественники, гидролиза практическине происходит. Полимеризация предотвращает гидролиз с 3'-конца.По всей вероятности, репликация ДНКидет с высокой точностью, так как спаривание оснований проверяется дважды. В техслучаях, когда пара оснований не вмещается в двойной спирали, полимеризация обычно не идет. Однако, если на этом этапевсе-таки произойдет ошибка, она можетбыть исправлена раньше, чем будет присоединен следующий нуклеотид. Такимобразом, ДНК-полимераза I проверяет результат каждого проведенного акта полимеризации, прежде чем перейти к следующему.Кроме того, ДНК-полимераза I можетгидролизовать ДНК, начиная с 5'-конца цепи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
