Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 17)

Общая схема ферментативной реакции включает образование фермент-субстратного комплекса, в активном центре которого и происходит разрыв старых и образование новых связей с появлением продукта.

Одной из возможных причин ускорения протекания реакций может явится снижение энтропии связанных с ферментом молекул реагентов по сравнению с их свободным состоянием. Строгая ориентация облегчает взаимодействие реагентов, позволяя реакции проходить быстрее.

Существует релаксационная(равновесная) концепция ферментативного катализа. В ней проявление продукта рассматривается как результат последовательных конформационных изменений в фермент-субстратном комплексе, индуцированных первоначальными изменениями электронного состояния в активном центре фермента. Вначале, в течение короткого времени (10-12 – 10-13с), происходят электронно-колебательные взаимодействия, затрагивающие только выделенные химические связи субстрата и функциональные группы фермента, но не остальную часть белковой глобулы. Вследствие этого создается конформационно-неравновесное состояние, которое релаксирует к новому равновесию с образованием продукта. Процесс релаксации идет медленно, и носит направленный характер, включая стадии отщепления продукта и релаксации свободной молекулы фермента к исходному равновесному состоянию.

Образование многоцентровой активной конфигурации.

На первом этапе катализа стохастический характер динамики белковой глобулы фермента и диффузии субстрата к активному центру приводят к образованию строго определенной конфигурации, включающей функциональные группы фермента и химические связи субстрата. Формально это соответствует соударению нескольких молекул, что в растворе –маловероятно.

Вероятность попадания нескольких групп в реакционную область определенного радиуса, где они оказываются сближенными на короткие расстояния зависит от коэффициента диффузии и числа степеней свободы функциональных групп, ищущих друг друга в ограниченном пространстве. Среднее время образования такой активной конфигурации составляет 10-2 – 10-4 с-1 , что совпадает с временами оборота фермента в условиях субстратного насыщения. В растворе для аналогичной реакции это время намного больше.Причина состоит в том,что, попав в ограниченную область в плотноструктурированной среде, группы находят друг друга быстрее,чем разбегаются в стороны. Увеличение числа функциональных групп и необходимых одновременных контактов между ними увеличивает время достижения многоцентровой активной конфигурации. Общая скорость ферментативного катализа определяется именно временем образования нужной конформации при спонтанном сближении групп в активном центре. Последующие электронные взаимодействия происходят быстро и скорость не лимитирует.

Механизмы регуляции процессов фотосинтеза при облучении организма светом

различной интенсивности и спектрального состава.

http://www.biophys.msu.ru/general_courses/biophysics/pogosyan/13.pdf

Билет 20

Принцип работы и применение методов ЭПР и ЯМР в исследованиях динамики макромолекул.

Диамагнетики не взаимодействуют с магнитным полем. Парамагнетики — частицы,чей суммарный спин не равен 0.например,свободные радикалы.

Способы обнаружения:

--косвенно химически по цветным реакциям

--напрямую по физическим характеристикам с помощью эпр.

Создается большое магнитное поле. От этого парамагнитик имеет 2 состояния спина, а не одно неопределенное. Затем делают переменное поле и ищут яму.дельта Е=g (фактор спектроскопического расщепления)×бета (константа,связывающая магнитный и механический моменты)×Н (напряженность поля).

по графику производной dE/dH от Н можно определить что это и сколько его. Еще на график влияет вязкость среды.

+можно делать метки(навешены ковалентно) и зонды (навешены нековалентно). Можно определить перенос электрона по цепи.

Электронный парамагнитный резонанс(ЭПР)-резонансное поглощение электромагнитной энергии в сантиметровом или миллиметровом диапазоне длин волн веществами,содержащими парамагнитные частицы.

Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) основан на взаимодействии вещества с магнитным полем. Как следует из названия метода, он применяется для исследования парамагнитных частиц. Известно, что при помещении парамагнетиков в магнитное поле, парамагнетик втягивается в это поле. Это связано с наличием у парамагнетиков магнитных моментов. Магнитные моменты создаются неспаренными электронами. Примерами парамагнитных частиц, представляющих интерес для биологов, служат свободные радикалы, являющиеся промежуточными продуктами биохимических реакций, ионы металлов переменной валентности, таких как железо, медь, марганец и др. Проявление магнитного момента у электрона связано с тем, что электрон является заряженной частицей, и при вращении электрона вокруг своей оси (спиновое движение) возникает магнитное поле, направленное вдоль оси вращения. При помещении парамагнитного образца в магнитное поле магнитные моменты неспаренных электронов ориентируются в этом поле, подобно тому, как это происходит с магнитными стрелками. Магнитный момент неспаренного электрона во внешнем магнитном поле может ориентироваться двумя способами - по полю и против поля. Таким образом, если в исследуемой системе имеются неспаренные электроны, наложение внешнего магнитного поля приводит к разделению электронов по группам: магнитные моменты одних электронов ориентированы по полю, других – против.

Каждой из ориентаций магнитных моментов электронов соответствует свободная энергия.

Разница в энергии электронов определяется выражением

ΔE1 = Е2 - Е1 = g⋅β⋅H (1)

где: β - константа, называемая магнетоном Бора и равная 9.27.10-21 эрг/Гс, а g - константа, называемая g - фактором и равная 2, когда магнитный момент электрона является спиновым магнитным моментом, H - напряженность магнитного поля.

Величина ΔЕ может быть выражена и другим способом, а именно ΔЕ⋅=⋅hν, где hν - величина кванта энергии, необходимого для перевода электрона из одного состояния в другое.

Объединяя оба выражения для ΔЕ, можно записать: hν = g⋅β⋅H Это выражение носит название условия резонанса.

Если к находящейся в магнитном поле системе, содержащей неспаренные электроны, подвести высокочастотное излучение с частотой ν, определяемой условием резонанса, то в исследуемой системе возникнут вынужденные электронные переходы между соседними уровнями Е1 и Е2. Переходы с одинаковой вероятностью будут происходить как из состояния Е1 в состояние Е2, так и наоборот. Однако, число переходов снизу вверх больше числа переходов сверху вниз, поскольку в соответствии с законом Больцмана заселенность нижнего уровня выше. Переходы из верхнего состояния в нижнее происходят с испусканием энергии, а переходы из нижнего в верхнее - с поглощением. Но поскольку число переходов снизу вверх больше, то в целом при выполнении условия резонанса в образце будет наблюдаться поглощение высокочастотного излучения. Частота, при которой наблюдается резонансное поглощение высокочастотного излучения образцом, связана с напряженностью магнитного поля:

νβ=gH/h

Из этого выражения видно, что резонансное поглощение можно наблюдать:

а) при изменении частоты ν электромагнитного излучения при постоянстве H

б) при изменении H при постоянстве ν.

Из технических соображений применяется второй способ регистрации.

В спектрометрах ЭПР сигнал регистрируется не в интегральном виде (рис.2.), а в виде первой производной.

Регистрация сигнала ЭПР в виде первой производной оказывается предпочтительной в связи с тем, что при таком способе регистрации удается поднять чувствительность спектрометра на несколько порядков по сравнению с регистрацией сигнала в интегральном виде.

Для характеристики сигналов ЭПР употребляется набор параметров. Одним из таких параметров является амплитуда сигнала I (рис.3б), которая характеризует интенсивность сигнала. Величина I измеряется в подавляющем большинстве случаев в относительных единицах (например в мм). Ясно, что чем больше концентрация парамагнитных частиц в образце, тем больше будет величина (при неизменности ширины сигнала). Величиной, характеризующей ширину сигнала, служит ΔHmax - ширина линии между точками максимального наклона (рис.3б.). Эта величина измеряется в единицах магнитного поля - гауссах (Гс) или миллитеслах (мТл). Для того, чтобы измерить ΔHmax в единицах магнитного поля, необходимо знать масштаб по оси абсцисс на ленте самописца (т.е. знать сколько гаусс приходится, например, на 1 см на ленте самописца). Для измерения ΔHmax применяются специальные эталоны.

Сигнал ЭПР обладает не узкой линией, а полосой поглощения с определенной шириной. Это значит, что уровни спинового взаимодействия несколько размыты. В первую очередь это объясняется взаимодействием не только с тем магнитным полем, которое создается прибором, но и с другими: спин-спиновые взаимодействия создают дополнительные локальные магнитные поля в местах расположения соседних спинов, меняя таким образом строгое условие резонанса (уширяя линию поглощения). Этим процессам соответствует время Т. Оно тем больше, чем меньше спин-спиновые взаимодействия. Ширина линии поглощения зависит от Т следующим образом:

ΔH=1/Т

Если вязкость в образце мала, то за счет быстрых молекулярных движений взаимные влияния успевают усредниться при поглощении переменного поля. В этом случае резонанс наблюдается при усредненной линии с уменьшенной шириной. Если же вязкость повышается (например, при замораживании), то скорость молекулярного движения замедляется, и спины успевают почувствовать влияние разных локальных полей. Время Т сохранения спинового состояния уменьшится, а ширина линии – увеличится. Таким образом по ширине линии можно судить о характере внутримолекулярных движений в микроокружении спиновой частицы. В методе ЭПР обычно применяются нитроксильные радикалы.

Оказалось, что время вращения метки зависит от глубины её погружения в белковую глобулу: оно больше в гидрофобном ядре глобулы и меньше на гидрофильной поверхности. Таким образом, по ширине линии поглощения можно судить о подвижности молекул. Более того, подвижность метки зависит от функционального состояния фермента.

Метод ЯМР-спектроскопии

Нужны ядра с ненулевыми спинами (нечетная масса)

Смотрят химический сдвиг (процентное отношение к тетраметилсилану). Получают график с пиками.можно определить стереоизомеры. Соседние группы влияют на спектр.

в принципе схож с методом ЭПР. Во внешнем магнитном поле ядра некоторых атомов ориентируются строго определенным образом. В результате происходит разделение молекул по энергиям и можно записать ту же формулу для разности энергий ядер: ΔE1 = Е2 - Е1 = g⋅β⋅H

С той лишь разницей, что константы g и β имеют другие численные значения.

Величина ΔЕ может быть выражена и другим способом, а именно ΔЕ⋅=⋅hν, где hν - величина кванта энергии, необходимого для перевода электрона из одного состояния в другое.

Объединяя оба выражения для ΔЕ, можно записать: hν = g⋅β⋅H Это выражение носит название условия резонанса.

Если к находящейся в магнитном поле системе подвести высокочастотное излучение с частотой ν, определяемой условием резонанса, то в исследуемой системе возникнут вынужденные переходы между соседними уровнями Е1 и Е2. Переходы с одинаковой вероятностью будут происходить как из состояния Е1 в состояние Е2, так и наоборот. Однако, число переходов снизу вверх больше числа переходов сверху вниз, поскольку в соответствии с законом Больцмана заселенность нижнего уровня выше. Переходы из верхнего состояния в нижнее происходят с испусканием энергии, а переходы из нижнего в верхнее - с поглощением. Но поскольку число переходов снизу вверх больше, то в целом при выполнении условия резонанса в образце будет наблюдаться поглощение высокочастотного излучения. Частота, при которой наблюдается резонансное поглощение высокочастотного излучения образцом, связана с напряженностью магнитного поля:

Характеристики

Список файлов вопросов/заданий