Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 87
Текст из файла (страница 87)
ТЬе ппс1еогьйе аелпепсе о( ЬассепорЬаке фХ174. !. Мо!. ВГО. 125, 225 — 246, 1978. Основные генетические механизмы 307 последовательность ООСССС и комплементарную ей область друзой цепи точно посередине, в результате чего образуются рестрикционные фрагменты с «липкими» или «тупыми» концами.) Б. Правильно. В.
Правильно. Г. Неправильно. Из-за присутствия интронов в геномных клонах по ним почти невозможно определить аминокнслотную последовательность кодируемых белков. Поскольку при синтезе мРНК интроны удаляются, аминокислотную последовательность можно установить с помощью клонов кДНК. Д. Неправильно. Антитела должно быть направлены против белка, кодируемого данной мРНК, Е. Правильно. Ж. Неправильно.
Эукариотический геномный клон, вероятно, содержит интроны, которые будут мешать правильной экспрессии белка в клетках бактерий. 3. Неправильно. Трапез енные животные образуются за счет включения ДНК в хромосомы клеток зародышевой линии, благодаря чему чужеродная ДНК присутствует в последующих поколениях организма. 5' 3 — с т а сла†— аксатс з 5' 5' 3 — аактсс— -ссткаа- 3 5 Ввглн~ 5' з 5' 3' -стаса а а ксатс- 3' 5' з 5' 5' 3' 5' з а актсс-сстаа а з 5' 3' 5' ДНК-лолимврввв ДНК-лолнмврвзв стаса а а ксатс актсс сткаа- -ааатс — сетха ДНК-лигввв фага Т4 аксатс ДНК-лигвзв фвгв Т4 ссткастйаа Твя! Рис. 5-58.
Расщепление, модифика- ция и сщивакие ДНК, содержащей ВвтН1-лайт или Р531-свйт 1ответ 5-48). 35 5-48 А. 5'- и 3'-концы разрезанных молекул показаны на рис. 5-58. Последовательности ДНК обычно представляют таким образом, что 5'-конец верхней цепи находится слева. Б. Как показано на рис. 5-58, концы, образующиеся при обработке ВатН1, могут быть достроены ДНК-полимеразой, а концы, образующиеся при обработке Р531,— нет. Это различие объясняется известным свойством ДНК-полимеразы: для ее работы необходимы праймер с 3'-ОН-концом, к которому могут присоединяться дезоксинуклеозидтрифосфаты, и матричная цепь, определяющая, какой нуклеотид должен присоединиться.
Эти требования выпол- 308 Глава б няются в случае ВашН1-концов, но не в случае концов, образуемых рестриктазой Рзг1, которая разрезает дальше от 5'-конца, в результате чего фрагменты не достраиваются ДНК-полимеразой, так как 5'-конец не может служить затравкой. Примечание: обычно в методе рекомбинантной ДНК используется ДНК-полимераза фага Т4, чтобы «затупить» концы обоих типов.
Концы ВашН1 будут «затупляться» в результате пришивания к ним соответствующих нуклеотидов, как показано на рис. 5-58. Однако Рз11-концы также будут затупляться благодаря ассоциированной 3' — 5'-экзонуклеазной активности, которая удаляет участок у 3'-конца, оставляя тупой конец. В. Как видно на рис.
5-58, затупленные концы в случае ВашН! и немодифицированные концы в случае Рм1 могут соединяться ДНК-лигазой фага Т4. Г. Соединение обработанных концов приводит к восстановлению Рм1-сайта, но не ВашН1-сайта. За счет соединения достроенных концов в случае ВашН! образуются два новых рестрикционных сайта, как указано на рис. 5-58. Расщепление, достраивание на концах и соединение концов заново часто приводят к появлению новых рестрикшюнных сайтов, которые иногда полезны для дальнейших манипуляций с ДНК, 5-49 А. Четыре центральных нуклеотида в сайте, узнаваемом ВашН1, образуют сайт, узнаваемый ЯапЗА.
Поскольку бапЗА узнает только эти четыре пуклеотида, все ВатН1-сайты будут разрезаться ферментом БапЗА, Обратного, однако, не может быть, потому что ВатН1 узнает сайт, состоящий из шести нуклеотидов. Таким образом, ВашН! будет разрезать только часть сайтов, узнаваемых ЯапЗА, у которых есть соответствующие соседние нуклеотиды (т.е. 5'О и 3'С).
Поскольку в среднем один из четырех соседних нуклеотидов на каждой стороне окажется правильным, то лишь одно из 16 возможных расположений двух пограничных нуклеотидов будет подходящим для того, чтобы сайт расщеплялся ВашН1. Таким образом, только 1 из 16 сайтов, узнаваемых ЯаиЗА, будет разрезаться ВашН1. Б. Поскольку для ВапЗА, как уже было отмечено, не имеют значения пограничные нуклеотиды, все гибридные сайты ЯапЗА/ВашН! могут разрезаться с помощью ЯапЗА. Однако с помощью ВашН! будет разрезаться в среднем только один из четырех гибридных сайтов.
В гибридном сайте пять из шести нуклеотидов будут соответствовать ВатН1-сайту; шестой нуклеотид окажется правильным примерно в одном из четырех гибридных сайтов. В. Вероятность того, что любая четырехнуклеотидная последовательность окажется ЯапЗА-сайтом, равна (1~4)4, нли 1 из 256, в выбранной случайным образом последовательности ДНК, где все четыре нуклеотида встречаются с одинаковой частотой. Таким образом, сайт, узнаваемый ЯапЗА, будет встречаться в среднем один раз на 256 п.н. в цепи ДНК.
Сайт, узнаваемый ВаглН1 и состоящий из шести нуклеотидных пар, будет встречаться один раз на 4096 п. н. ((1(4)~ = 4096) в случайной последовательности ДНК. А. Сложность набора фрагментов после сшивания объясняется тем что соединяться могут любые два ВашН1-конца. Таким образом, при соединении фрагментов длиной 0,4 т, п.н. может создаваться целый набор фрагментов с размерами 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 т.п. н. и т. д. Основные генетические механизмы 309 Ряс. 5-59. Различные положения фрагментов 0,4 н 0,9 т.п.в., полу- ченвмх путем обработки ВатН1, арн образовавнн фрагмента 1,3 т.ц.
к, (отает 5-50). й! М Ф !яйР 4ввяв Ф Ф Ф!и Фввв й! й! Подобно этому, фрагменты длиной 0,9 т.п.н. будут соединяться с образованием набора следующих фрагментов: 1,8; 2,7; 3,6 т. п. н. и др. И наконец, комбинации двух фрагментов дадут третий набор фрагментов с размерами 1,3; 1,7; 2,1; 2,2 т. п. н. и т. д. (Наблюдаемая картина распределения часто еще более сложна, так как эти фрагменты при соединении их концов могут образовывать кольцевые структуры.) Б.
Поскольку два любых ВашН1-конца способны соединяться межлу собой, то могут возникнуть одинаковые по размеру, но различающиеся по структуре фрагменты, как показано на рис. 5-59 для фрагмента размером 1,3 т. п.н. Обработка популяции фрагментов размером 1,3 т.п.н. рестриктазой Есой1 приводит к образованию разнообразных фрагментов с размерами от 0,1 т.п.н. (см. левые концы структур 3 и 4, рис. 5-59) до 1,0 т.п.н.
(см. внутренние фрагменты структуры 4, рнс. 5-59). карт, очень похож на тот, который используется при химическом секвенировании ДНК. В обоих случаях молекулы метят на одном конце, затем частично фрагментируют с помощью неполного расщепления в нескольких специфических сайтах и, наконец, распределяют фрагменты по размерам. Длина меченого фрагмента указывает на расстояние от меченого конца до сайта, по которому произошло расщепление. Рестрикционная карта, полученная на основе радиоавтограммы, изображенной на рис.
5-42, представлена на рис. 5-60, где она сопоставляется с продуктами неполного расщепления, производимого одной рестриктазой (см. штриховые линии). Размеры рестрнктов оценивают путем сравнения с набором маркерных фрагментов на рис. 5-42. (Из рисунка видно, что расстояние, на которое мигрируют эти фрагменты при электрофорезе, связано с их размерами нелинейно, чем могут объясняться различия между вашими оценками и оценками, представленными на рис. 5-60.) в н! я й! ! ! ! ! 9 Ф вЂ” 0>4! ! ! з,т з,о 5-52 На рис. 5-61 показаны два участка полученного вашим коллегой белка, характеризующиеся наименьшей многозначностью, и соответствующие этим участкам олигонуклеотидные зонды. Кодоны приведены под последовательностью аминокислот в форме РНК, чтобы легче было перейти к генетическому коду.
Олигонуклеотиды показаны в виде последовательностей ДНК, т.е. в том виде, в каком они будут синтезированы. (Комплементарные им последовательности тоже могут служить хорошими зондами.) Синтез олшонуклеотидов производят путем последовательного присоединения нуклеотидов, так что за один тщательно контролируемый цикл химических реакций присоединяется один нуклео- 3,4 Ряс. 5-60.
Карта рестрикции кло- якрованного вами сегмента ДНК я продукты частичного расщепле- вяя, цо которым ова составлена (етвет 5-50). Чвсла рядом с фраг- ментами означают вх длину, опре- деление которой цронлдюстрвро- яаво на рис. 5-42. 5-51 Принцип, на котором основан метод построения рестрикционных 310 Глава б 5 гс 15 го 25 зо м г т и м 1 0 В я т е и и м Р ь т м к О Р и А к н в ь 1 с е Апо ООСОАС 000А пояпАООААаяяосясяояяоясп 00АОаССАО ОАпАСАпаАААОАСп ОС 0000СААААСАСАОСппялпАп 0С0АА Опп пап АпсаослаояоОАСсохоояп СССООООАО Аяоалпоцп 0ССААОСАОАОппооАпСпопаА6 АОО000С0АПСААС0 СС0СОА 0С0 ПСАСПААОП 00ОС0СОССАСОСПС 0СО ПСССОС СОООС6СО0 ОСССОО С60ОСОСПП ОСОСОО АТОТТСТАСТ00АТ6АТА06 ТАСАТОААА0АСТТСТ000С Т Т С Т 0 Т Т Т к 5 ' тлаяалсссаялааасааса 3 ' оААтстстааас тсссассасАатА6 1/ 6 6 5'ТА6А6АССС666660С66ССТ 3' аяятстстаоос сссоссаслатяо l 6Т О вЂ” Деления Ьа 1 5'ТАСАСАССС666С06ССТСА 3' аядтстстааасссассаслатяо 6ТС Рнс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
