Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 86
Текст из файла (страница 86)
Например, мутации в гене тимидинкнназы либо в гене ДНК-полимеразы могли бы изменить специфичность ферментов так, что они больше не узнавали бы ацикловир нли ацикло-ОТР, или же мутация могла бы полностью исключить возможность образования продуктов этих генов. При мутации, Основные генетические механизмы 303 вызывающей элиминацню тимидинкиназы вируса герпеса, его жизнеспособность сохраняется, так как этот вирус может использовать тнмидинкиназу клетки-хозяина.
Однако мутации, элиминирующие ДНК-полимеразу вируса герпеса, легальны для него. Очевидно, вирус герпеса нуждается в своей особой ДНК-полнмеразе, которую не может заменить ДНК-полимераза клетки-хозяина. 5-41 А. Описанный здесь тест с кружками - это разновидность классического теста на комплементацию, который позволяет решить, дефектны два мутанта по одному и тому же гену или по разным генам. Если пара мутантов дефектна по одному и тому же гену, они не могут «помочь» друг другу при инфицировании (так как им обоим недостает продукта одного и того же гена) н, следовательно, прн смешанной инфекции они растут не лучше, чем порознь. Напротив, если два мутанта имеют дефекты в разных генах, они могут «помочь» друг другу: в смеси будет присутствовать по крайней мере одна функциональная копия каждого гена,и, следовательно, они смогут расти как смесь мутантов.
Результаты теста с кружками в случае гп-мутантов показывают, что последние разделяются на две группы по комплементацин. Мутанты 2, 5 и 8 имеют дефект в одном гене, а мутанты 1. 3, 4, 6 и 7 — в другом гене. В классических экспериментах было показано во многом сходным образом, что есть два ги-гена. гпх н г,ш.
Б. Как следует из предыдущего ответа (пункт А), если бы вы повторили тест, используя Е. сой К, инфицированную мутантом 3, то увидели бы такую же картину, как и в тесте, где использовадась Е. сод К, инфицированная мутантом 1, дефектным по тому же гену. В. Небольшая фракция фага Т4 дикого типа возникает в смеси мутантов 1 и 5 в результате генетической рекомбинации. Вирусные геномы, растущие в одной клетке, будут рекомбинировать время от времени. Если рекомбинация произойдет между мутантными генами, то может возникнуть геном дикого типа, как показано на рис.
5-55. Поскольку частота рекомбинашти почти пропорциональна частоте разделения мутаций, то величину фракции фагов дикого типа при генетических кроссинговерах между мутантамн можно точно измерить, чтобы определить порядок и расположение мутаций вдоль хромосомы (что и было осуществлено). Лятература! Сгтсд ЕН4 Вгсннсг, Я. ТЬе аЬао1ше ияп о1 сег!атп РЬаае-зийй тпшапы тп Ьвс!епорЬвяе Т4. 1.
Мо1. Вг!. 26, 361 -363, 1967. 5-42 Вирус 1 — это типичный вирус с негативным геномом, подобный вирусам гриппа и везикулярного стоматита. Его РНК непосредст- м! — — Мутант ! — — Мутант В Гомоногнчнаа ракомбннацна в точка "а" м! Двойной мутант Рис. 5-55. Рекомбииация межлу двумя мутаитами с образованием гоиома дикого типа 1ответ 5-41). 304 Глава б венно не кодирует белки, а вирусная частица содержит РНК-зависимую РНК-полимеразу.
В ходе инфекции РНК-зависимая РНК- полимераза использует негативную цепь РНК в качестве матрицы для синтеза позитивной цепи, которая выполняет роль мРНК для вирусных частиц. Позитивные цепи РНК в свою очередь, используются как матрицы для синтеза более крупных геномных (негативных) цепей. Вирус 2 — это типичный вирус с позитивным геномом, подобный полиовирусу. При инфекции он служит в качестве мРНК для вирусных белков, один из которых является реплнказой, которая делает с позитивных цепей их копии — негативные цепи, а затем с негативных цепей — геномные (позитивные) цепи. Вирус 3 — это ретровирус, подобный вирусу СПИДа (А)РВ).
Хотя его РНК может служить в качестве мРНК, однако обычно в ходе инфекции этот путь синтеза белка не используется. Вместо него геномная РНК копируется в ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы. ДНК объединяется с хромосомой клетки-хозяина„а затем начинает служить матрицей для образования мРНК с последующим синтезом вирусных белков и геномной РНК-для создания потомства вируса. ЦИРКУЛЯРИЗАЦИЯ ИНТЕГРАЦИЯ 1 « — — 8 т.п.н.— — н.
« — 0,8 тл.н, т Рве. 5-56. Интеграция генома ретровируса с двумя наборами тандемно расположенных ЬТК (ответ 5-43), а — — 8 т.п.н.— — и Интатрнреаанная 5-43 Приведенные результаты указывают на то, что наиболее вероятным предшественником интегрированной формы генома ретровирусов является кольцевая ДНК с тандемно расположенными ЬТК. Картину гибридизации можно понять, обратившись к рис. 5-56. Кольцевая форма с двумя наборами тандемно расположенных Основные генетические механизмы ЗОВ 1.ТК может встраиваться двумя способами, как показано на этом рисунке. Поскольку в популннии клеток содержатся интегранты обоих типов, то обработка любой рестриктазой приводит к образованию двух фрагментов: 0,8 и 8 т.п.н. Кольцевая ДНК с одним 1.ТК не может служить предшественником для интеграции, потому что (по аналогии с рис.
5-56) в случае интеграции кольцевых форм с одним 1.ТК обработка рестриктазой должна была бы приводить к образованию еще двух фрагментов: 0,4 и 8 т.п.и. Недавние эксперименты с использованием различных ретровирусов убедительно показали, что предшественником для интеграции является линейная форма. Причина таких расхождений в выводах пока неясна, она просто может быть обусловлена различиями между ретровирусами.
Литература: РапдатЬап, А Т; Тетт, Н. М. С!гс1ее и 11!г !ио !лепет Г.ТКе аге ргеспгеоге го !п!еяга!ед ге!гог1гпе 131чА. Сей 36, 673 — 679, 1984. Вгони, Р. 041 Вонегтап, Вс Ггагтиг, Н.Е.г ВиЬор, Х М. Сопес! !пгеягацоп оГ геггохйга! ГЗГЧА гп М!го. Сей 49, 347 — 356, 1987. Рнугюага, Тс МГгиигы, К. Кеггомга! Гп!еягабоп: еггпсгпге оГ ап !пгеягабоп !и!еппегГ!аге. Сей 54, 497 — 504, 1988. 5-44 А. Все колонии появились только в результате встраивания Тп!0 в бактериальный геном, потому что выживание зависит от присутствия гена устойчивости к тетрациклнну„переносимого Тп10.
Наличие смешанных колоний с синими и белыми секторами — это ключевой результат. Поскольку частота встречаемости секторных колоний высока, а транспозиция — это редкое событие, то секторные колонии должны возникать в основном прн единичной транспознции. В случае репликативного механизма может переноситься только одна цепь родительского гетеродуплекса и, таким образом, могут образовываться только белые или синие колонии в зависимости от того, какая из цепей переносится.
При нерепликативном способе, напротив, переносятся обе цепи гетсродуплекса, и в результате репликацин и сегрегации в дочерних клетках бактерий онн дают начало секторным колониям. (Если исходно бактерии были распределены по поверхности агаровой среды в чашке Петри, то все потомки первоначальной инфицированной клетки, оставаясь в непосредственном контахте друг с другом, образуют колонию. Если при первом делении образуются две разные дочерние клетки, то их потомки размножаются рядом, создавая единую колонию, но с секторами, образуемыми двумя вариантами бактерий.) Чисто синие н чисто белые колонии возникают в результате транспозиций, в которых участвуют гомодуплексы.
Количественное соотношение синих, белых и секторных колоний определяется тем, что гетеродуплексы (дающие начало секторным колониям) н гомодуплексы (дающие начало колониям одного цвета) содержались в смеси в равных количествах. Б. Каждый гетеродуплекс содержит область ДНК с неправильным спариванием, соответствующую положению мутации в ГасУ-гене.
Если эти гетеродуплексы ввести в бактерии, которые могут репарировать такие неправильные спаривания, то частота появления секторных колоний будет ниже, чем в описанном опыте. По-существу каждый акт репаративного восстановления должен превра!цать гетеродуплекс в гомодуплекс. Если репарация неправильного спаривания оснований будет спонтанной, ненаправленной, то ча- 306 Глава б стота появления синих и белых колоний должна возрасти одинаково.
В. Если бы вы использовали интегрируемую форму фагового генома, то выжившие колонии могли бы образоваться в результате сайтспецифической рекомбинации, которая происходит чаще, чем транс- позиция. При сайт-специфической рекомбинации обе цепи фагового генома встраиваются (как описано в МБК, см., в частности, рис. 5-67). Таким образом, доля синих, белых и секторных колоний была бы такой же, как в случае нерепликативной транспозиции. Действительно, в реальных исследованиях, проведенных для выяснения механизма транспозиции Тп!0, в качестве положительного контроля использовали интегрируемую (но нереплицирующуюся) форму бактериофага лямбда.
В обоих экспериментах были получены одинаковые результаты. Литература: ВеЫе«, Ус К!ес/гнег. ЯГ. Степе11с етнепсе птаг Тп!О ггапероаеа Ьу а попгер11саг(те птесьап1епт. Се!1 45, 801 — 815, 1986. т Ген К т Ген А о г»в Клонирование ДНК и генная инженерия — — тасяя —— 5-46 А. рестрицирующие нуклеазы; рестрикционные фрагменты (рестрикты) Б. векторы клонирования В, клон Г. клон геномной ДНК; библиотека геномной ДНК Д. библиотека кДНК Е. субтрактивная гибридизапия Ж.
«прогулка по хромосоме» 3, гибридизацнонная селекция И. экспрессирующие К. комбинированный белок Л. трансгенные М.полимеразная цепная реакция Ген К и Ген А е Ген  — — тАОАА —— Поеееаоеетееьноеть ДНК Рис. 5-57. Множественные мутапиоппые изменения, вызываемые изменением единственного основания в области перекрывания генов (ответ 5-45). 5-47 А.
Правильно. (Например, рестрицирующая нуклеаза Бгпа1 разрезает 5-45 А. Поскольку у бактериофага фХ174 есть только одна мРНК, то все четыре его гена должны быть закодированы в этой РНК. При синтезе белка рибосомы движутся вдоль мРНК в направлении от 5'- к 3'-концу, поэтому все четыре гена транслируются, как указано на рис.
5-37, слева направо. Б. Гены А, В и К должны транслироваться в разных рамках считывания, т.к. стоп-кодон в конце гена В обходится при синтезе А и К, а стоп-кодон в конце гена А обходится при синтезе К. Аналогичным образом гены А, К и С тоже транслируются в разных рамках считывания. Имеются только три отдельные рамки считывания (поскольку каждый кодон состоит из трех нуклеотидов), поэтому гены В и С должны транслироваться в одной и той же рамке считывания. В. Как показано на рис. 5-57, мутационные изменения в генах К и В связаны с заменой кодона треонина (АСА) на кодон аргинина (АСА) в гене А. Ген С при этом не изменяется. Литература: хапдег, К ег а1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
