Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 89
Текст из файла (страница 89)
Остальная половина молекул фосфолипида 1 была доступна действию аскорбиновой кислоты, следовательно, половина метки находилась в наружном монослое мембраны. Лвтератураг ГгоиггеГое А., бигlииалл, С., Магг!гол, у„йголоелие, А., Ггеоаиг, Р. Е ВгигГу оГ гпе ггапзтегзе гГ!ГГпз!оп оГ зр!и !аЬе!егГ рпотрЬо!!р!гГз гп Ью!оя!са! гпепгЬгапек 1. Нпюап ген Ыоод се1!к В!осЬ!пь ВюрЬук АсГа 426: 357 — 371, ! 976. 6-7 А. По данным этих экспериментов можно оценить полупериод транс- локации, есди экстраполировать кривую на рис. 6-4 до точки, в которой сигнал ЭПР снижается на 50%. Для клеток, меченных по внутреннему монослою, эти данные дают величину полупериода транслокации около 7 ч.
У клеток, меченных по наружному монослою, полупериод транслокации гораздо больше, но точность его оценки сомнительна. Эти данные показывают, что частота перескоков фосфолипидов между двумя монослоями плазматической мембраны эритроцита чрезвычайно низка. В экспериментах с искусственными бислоями были получены еще большие полупериоды; действительно, в самых удачных экспериментах, когда были приняты максимальные предосторожности против окисления или иных повреждений липидов, частота перескоков была неизмеримо более низкой (реже одного раза в месяц).
Б. Фосфолипид 2 был использован для мечения внутреннего монослоя, а фосфолипид 1 — для мечения наружного монослоя. Как следует нз рис. 6-3,В, фосфолипид 2 во внутреннем монослое не восстанавливается цитоплазмой эритроцитов, а в наружном монослое может быть восстановлен аскорбатом.
Таким образом, фосфолнпид 2 пригоден для измерения скорости транслокации от внутреннего монослоя к наружному. Как следует из результатов, приведенных на рис. 6-3,А, фосфолипид 1 во внутреннем монослое восстанавливается цитоплазмой эритроцита, но, находясь в наружном монослое, он стабилен в отсутствие аскорбата. Таким образом, фосфолнпид 1 пригоден для измерения скорости транслокации от наружного монослоя к внутреннему. В.
Можно получить интактные эритроциты, содержащие спин-меченые фосфолипиды исключительно во внутреннем монослое. Процедура заключается во введении фосфолипида 2 в мембрану Ппвзмагическая мембрана 315 эритроцитов и последующей инкубации в течение часа в присутствии аскорбата. Последний восстанавливает липид в наружном монослое, не затрагивая меченый лнпид, попавший во внутренний монослой мембраны эритроцитов. Подобным же образом спин- меченый фосфолипид 1 можно ввести исключительно в наружный монослой: мембрана эритроцитов метится этим фосфолипидом, затем клетки инкубируют 15 мин в среде без аскорбата, При этом спин-меченый фосфолипид ! во внутреннем монослое восстанавливается соединениями, присутствующими в цитоплазме, и метка остается только в наружном монослое, литература: лопме1ег.
А., бигйгпапп, с., магг!гоп, д, рдепиепие, А., !!еоаих, Р. е удоду о! гйе ггапзхегее 6!1!не!оп о! ер1п 1аЬе1ег! рйозрЬо!1рие ю Ь1о!ок1са! пгегпЬгапек !. Нпгпап ге<! Ыоой се11а ВюсЬпп. ВюрЬуа Асса 426: 357 -371, 1976. Мембранные белки 6-8 А.
трансмембранные Б. периферические мембранные; интегральные мембранные В. детергенты Г. денатурируют Д. векторное мечение Е. спектрин Ж. белок полосы 3 3. замораживание — скалывание; Р-поверхность; Е-поверхность И. бактериородопсин К. фотосннтетический реакционный центр Л. вращательная; латеральная! перескок (флип-флоп), или транслокапия М.
гетерокарионы Н, восстановление флуоресценцни после фотовыцветания 6-9 А. Правильно. Б. Неправильно. Одно время считалось, что это точное описание биологических мембран, но, как теперь очевидно, многие мембранные белки погружены непосредственно в бнслой. В. Неправильно. Более вероятно, что трансмембранные сегменты таких белков представляют собой а-спираль. При а-спиральной структуре образуются все возможные водородные связи между группами атомов, удаленными друг от друга вдоль полипептндной цени, тогда как в 11-складчатом слое около половины возможных водородных связей совсем не образуется (см. МБК, рис.
3-25 и 3-26). Г. Правильно. Д. Неправильно. Эритроциты человека не имеют внутренних мембран; на ранних стадиях своего развития эти клетки утрачивают ядра. Е. Правильно. Ж. Правильно. 3. Правильно. И. Правильно. К. Неправильно. Апикальные н базолатеральные поверхности эпителиальных клеток, соединенных между собой плотными контактами, различаются по составу липидов. 316 Глава б До снх пор в биологических мембранах обнаружено только связывание белков по типу А, Б, Г, Д и И.
Типа В, при котором углевод расположен на цитоплазматнческой стороне мембраны, по-видимому, не существует. Встраивания по типу Ж и 3, когда белки погружены либо полностью, либо только своими концами, не обнаружено, и с теоретической точки зрения оно маловероятно. 6-10 6-11 А. Последовательность А — реальный пронизывающий мембрану сег мент молекулы гликофорина, трансмембранного белка зритроцитов. Это преимущественно неполярный сегмент, хотя в нем содержатся незаряженные полярные остатки треонина (Т) н серина (Я), которые являются довольно обычными компонентами белковых сегментов, пронизывающих плазматическую мембрану. Б.
Последовательность Б вряд ли является сегментом белка, прони зывающнм мембрану, потому что в ней содержатся три остатка пролина (Р), которые нарушали бы а-спиральную структуру, из-за чего группы, образующие водородные связи, оказывались бы открытыми в неполярном окружении внутри липидного бислоя. В. Последовательность В также не может быть трансмембранным сегментом, потому что она содержит три заряженных остатка— глутаминовую кислоту (Е), аргинин (К) и аспарагиновую кислоту ()3), присутствие которых в неполярном липидном бислое будет' энергетически невыгодным.
дазой указывает на то, что этот углевод экспонирован на поверхности. Он присоединен к гликофорнну, следовательно, глнкофорин также выступает на наружную поверхность. Этот вывод подтверждается результатами гндролиза полипептидной цепи проназой, в результате которого окрашивання реактивом Шиффа не происходит. Результаты обработки проназой показывают, что и белок полосы 3 также выступает на поверхность клетки.
В этом случае появление новой белковой полосы с молекулярной массой около 70000 дальтон позволяет сказать, что фрагмент белка полосы 3 с молекулярной массой около 30000 дальтон экспонирован на поверхности. Ни в том, ни в другом случае ферментативного гидролиза обе полосы спектрина не были затронуты, что свидетельствует об отсутствии спектрина на наружной поверхности мембраны.
Б. Один из вариантов экспериментальной проверки возражения ва- шей коллеги состоит в том, чтобы разрушить незамкнутые тени зритроцитов до того, как они будут подвергнуты обработке проназой. Если спектрин устойчив к действию проназы, его подвижность при электрофорезе в полиакриламцдном геле в присутствии детергента, додецилсульфата натрия, не должна измениться. Если, однако, спектрнн локализован на цитоплазматнческой поверхности мембраны и расщепляется проказой, его подвижность должна значительно измениться.
Эти контрольные эксперименты были проделаны и показали, что спектрин чувствителен к проназе. Другая возможная проверка состоит в том, чтобы получить вывернутые наизнанку тени зритроцитов н попытаться, если это возможно, отделить спектрин от мембран, не нарушая целостности последних. Этот подход был тоже успешно осуществлен; полученные результаты подтвердили, что спектрнн находится на внутренней, 6-12 А. Отсутствие окраски на сиаловую кислоту после обработки сиали- Плааматнчеекая мембрана 337 цитоплазматической поверхности клеточной мембраны и не погружен целиком в мембрану.
В. Для того чтобы при помощи этого основного экспериментального подхода определить, какие из белков эритроцитов пронизывают мембрану, необходимо приготовить вывернутые наизнанку пузырьки. Это можно сделать путем гомогенизации теней эритроцитов. В среде определенного ионного состава образовавшиеся мембранные фрагменты замыкаются. Если вывернутые пузырьки обработать проназой, то подвижность белков полосы 3 и гликофорина меняется.
Эти результаты вместе с другими, приведенными выше, указывают на то, что белок полосы 3 и гликофорин выступают на поверхность мембраны эритроцитов с обеих ее сторон, внутренней и наружной, следовательно, они должны быть трансмембранными белками. Литература: Веллеп, У., Ямльиск, Р.3. ТЬе агетЬтапе апасЬгпеа! рго!е!и !ог зрес!пп !а амес!а!ей ял!Ь Ьалд 3 !а Ьшпап егугбгосуге агетЬгааеа Ха!иге 280:468-473, !979. Веллеп, т'., 5гелЬиск, Р.3.
Амеснй!оп Ьеелееп аакупл аад гЬе сутор!ааю!с дома!л о! Ьапд 3 !ао!а!еб !тот гЬе Ьиатап егу!Ьгосуге теагьтаае. 3. Вге. СЬега. 255: 6424-6432, 1980. 6-13 А. Спектрин = 3 к 1О' молекул/клетку Белок полосы 3 = 9 х 10' молекул!клетку Гликофорин = 2,3 х 10' молекул~клетку Расчет числа молекул спектрина на один эритроцит делается следующим образом. Сначала рассчитывают долю от общего белка, которая приходится на спектрин, а затем переводят это число в число молекул спектрина, используя известную молекулярную массу спектрина и число Авогадро: спектрин 5 мг белка 0,25 спектрин ммоль спектрина х х х клетка ! 0'е клеток общий белок 250 000 мг б х 1Озе молекул х = 3 х 10 молекул.
ммоль спектрина Рассчитанное число молекул гликофорина на клетку является слишком низким (в 2,5 раза ниже, чем истинное), потому что 60'/о молекулярной массы гликофорина приходится на углеводную часть, которая не окрашивается белковым красителем Кумасси синим. Б. Доля поверхности плазматической мембраны, занимаемой белком полосы 3, равняется площади поперечного сечения молекулы этого белка (кгт), умноженной на общее число молекул белка полосы 3 (9 х 1О') и деленной на общую плошадь поверхности эритроцита (10' нм'). Заметьте, что длина молекулы в расчет не входит. белок полосы 3 3,14 х (3 нм)з 9 х 10' молекул х х плазматическая молекула клетка мембрана 1 клетка х = 0,25.
10а нм' Таким образом, белок полосы 3 занимает около четверти поверхности эритроцита. Этот до некоторой степени удивительный результат согласуется с данными электронной микроскопии, полу- Зэй Глава 6 ченными методом замораживания — скалывания. На фотомикрографиях хорошо видны электроноплотные внутримембранные частицы, которые, как считают, представляют собой днмеры белка полосы 3 (см. МБК, рис.
6-28). 6-14 Присутствие обоих белков на дне пробирки, как указано для смесей 3, 4 и 6 в табл. 6-4, свидетельствует о взаимодействии между этими белками, Судя по результатам опытов с двойными смесями, четыре указанных белка, возможно, соединены в такой последовательности: белок полосы 3-анкирин — спектрин-актнн. В МБК (см. рис. 6-26) графически изображены связи этих молекул в образуемой ими сети цитоскелета на цитоплазматической стороне мембраны эритроцитов. В действительности взаимодействие между актином и спектрином слишком с.пабое, чтобы его можно было определить таким образом, есчн только не будет добавлен третий белок — белок полосы 4,1. 6-15 А.
Скорости диффузии, приведенные в этой задаче, позволяют рассчитать следующие соотношения концентраций: при !О ем~~с (С„/Св) = 0,51, при 10 э смз/с (С ~С ) = 0,0013, при 1О гп ем~/с (С /Св) = 1,1 х 1О Подробно расчет такого отношения для скорости диффузии 1О ' см'/с выглядит следующим образом: 1' мкМ с 1 мин С ~Св=ехр — (1 — — х 40мкМ х — х х мин 1О 'смз 60с Таким образом, скорость диффузии 10 ' см'/с достаточна, чтобы сохранить почти равномерное распределение мембранного белка, тогда как более низкие скорости не приводят к такому эффекту.
При подобных расчетах используются определенные допущения, которые могут быть подвергнуты сомнению, тем не менее на основе этих расчетов можно ставить вопросы относительно того, с какой точностью разные экспериментальные методы позволяют измерять скорости диффузии белков. Эти нерешенные пока вопросы служат источником разногласий в данной области, их разрешение даст ценную информацию по вопросу о динамике мембран. Б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
