Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 88
Текст из файла (страница 88)
5-62. Три олигонуклеотида для сайт-направленного мутагенеза (ответ 5-53). Рие. 5-63. Нуклеотидная и амино- кислотная последовательности клонированного гена (ответ 5-54). Стоп-кодоны подчеркнуты. Амино- кислоты закодированы в рамке считывания 1. Ряс. 5-61. Два олигонуклеотида, которые могли бы служить зонда- ми для гена, выделенного вашим другом, показаны под соответ- ствующими участками последова- тельности мРНК, определенной путем «обратной трансляциия (ответ 5-52).
гид. Синтез смешанных олигонуклеотидных зондов осуществляет- ся более просто: за один цикл добавляют не один нуклеотид, а два, трн или все четыре — как считают нужным. Синтез сложной смеси не более труден, чем синтез чистого олигонуклеотида.
5-53 Три олигонуклеотида, которые можно использовать, чтобы получить желаемые изменения в белке, представлены на рнс. 5-62. Лучше, чтобы участок неправильного спаривания находился в центре олнгонуклеотида. Заметьте, что все три олигонуклеотида имеют одинаковую основную последовательность (см. рис. 5-44), комплементарную последовательности одноцепочечной ДНК вируса М13. Чтобы осуществить сайт-направленный мутагенез, олигонуклеотиды следует гибриднзовать с кольцевой одноцепочечной ДНК из рекомбинантного вектора (как показано на рис. 5-62), а затем достроить с помощью ДНК-полимеразы вторую цепь. Двухцепочечную ДНК следует затем ввести в клетки бактерий. и таким образом будет получен желаемый мутант. 5-54 Последовательность клонируемой ДНК показана на рнс.
5-63. Стоп-кодоны подчеркнуты и помечены цифрами 2 и 3, чтобы указать их рамку считывания. Как видно из этого опыта, гель для определения последовательности следует анализировать очень тщательно; пропуск одного нукдеотида будет иметь пагубные последствия при определении открытой рамки считывания. Чтобы застраховаться, лучше определять последовательность для обеих цепей ДНК. Поскольку они комплементарны, все ошибки будут тотчас обнаружены.
т к ь и и 6 Р е ь ч Р ч ч 6 Р О к 1 ь т атлхььястаалсллссяаттсаяастаататтсотаатсооттттслаядаятссйььс 3 2 ь т т ч и к ь 1 и и ч н к ь Р и и к 6стяьсатлсотьаясякатхаьтьялтаьтатасАтсоаста т т тсаА6АсАА6 тА с 2 2 2 2 3 Плазматическая мембрана Липидный бислой 6-1 А. липидный бислой Б. фосфолипиды; холестерол; гликолипиды В. амфипатические Г, полярная; гидрофобные углеводородные (жирные кислоты) Д.
мицеллы; бислойные пленки Е. лнпосомы; черные (черными мембраны называют потому, что взаимогасящая интерференция света, отраженного от двух поверхностей, делает их как бы черными; мыльные пузыри при белом освещении показывают интерференционные цвета, зависящие от толщины пленки) Ж. спиновая метка 3. фазовый переход И. гликолипиды К, галактоцереброзид; миелиновая Л. ганглиозиды, См~ б-2 А, Правильно.
Б. Неправильно. Липидные бислои- термодинамически стабильные структуры. Энергия исходно необходима для образования различных липидов, но для поддержания бислойного расположения этих липидов в мембране никакой дополнительной энергии не требуется. В. Правильно. Г. Неправильно. Текучесть мембраны существенно зависит также от длины боковых цепей жирных кислот и числа содержащихся в них Лис-двойных связей. Д. Правильно.
Е. Неправильно. Для мутантных клеток, которые не могут синтезировать холестерол, необходимо его присутствие в культуральной среде. В отсутствие холестерола их мембраны быстро разрушаются. Ж. Неправильно, Холиновая группа головы действительно заряжена положительно, но она связана с остальной частью липида фосфодиэфирной связью, а фосфатная группа несет при физиологических значениях рН отрицательный заряд.
Следовательно, фосфатидилхолин не несет чистого заряда. 3. Правильно. И. Правильно. (Гликолипиды синтезируются в полости аппарата Гольджи и не могут преодолевать мембрану по механизму транс- 312 Глава 6 локации. Ферменты, присоединяющие углеводы к липидам, в цито- плазме в свободном состоянии не обнаружены.) А~ о н — с — о — с — в ! из — с — Π— с — н о л н — с — о — Р— о — Холил с Каждую микроворсинку можно представить в виде цилиндра диаметром О,! мкм и высотой 1,0 мкм. По отношению площади боковой поверхности цилиндра, который представляет собой новую мембрану (относительно ровной мембраны, над которой микроворсинки возвышаются), к площади сечения цилиндра (эквивалентной площади плазматической мембраны, у которой нет выступающих над ее поверхностью микроворсинок), можно оценить увеличение площади поверхности за счет одной микроворсинки.
Площадь боковой поверхности цилиндра (2лгА, где г — радиус, а Ь-высота цилиндра),равна 0,31 мкм', площадь поперечного сечения цилиндра (ягз) равна 0,0079 мкмз. Таким образом, увеличение площади поверхности за счет одной микроворсинки равно 0,31 мкм'/0,0079 мкмз, т.е. 40. Однако зта величина дает завышенную оценку приращения поверхности плазматнческой мембраны за счет ворсинок, так как последние располагщотся лишь на части этой поверхности.
Долю поверхности плазматической мембраны, занятой микроворсинками, можно оценить по поперечному сечению, представленному на рис. 6-1. По приблизительным подсчетам лишь около половины поверхности плазматической мембраны покрыто микроворсинками. Они, таким образом, увеличивают площадь контакта клетки со средой во внутреннем пространстве кишки примерно в 40/2 раз, т.е. в 20 раз. Рве. 6-15. Специфическое расщеп- ление несколькими фосфолвцазами (ответ 6-4). Чувствительные связв указаны стрелками.
Специфические 4юсфолнпазы обозначены буквами: А,-фосйюлвпаза А,; Аз †фосфо- лицаза АБ С вЂ” фосфолнпаза С; Р-фосфолнлаза Р, и диацилглицерол, разрушая эфирную связь, которая соединяет фосфатную группу с глицеролом. Эта фосфолипаза по своей специфичности подобна фосфолипазе С (рнс. 6-15). На этом же рисунке представлен ряд других типов фосфолипаз: фосфолипазы А, и Аз, которые отщепляют цепи жирных кислот, находящихся в определенных положениях, и фосфолипаза П, которая отщепляет одну группу — полярную голову, но не затрагивает связь фосфатной группы с глицеролом.
Эти ферменты чрезвычайно полезны для анализа липидов. Некоторые из них выделяют нз ядов змей. Б. Для вас может быть неожиданным, что удаление гидрофильной полярной головы из фосфатидилхолина вызывает полное разрушение мембраны эритроцитов, тогда как удаление внешних остатков сиаловых кислот или расположенных снаружи доменов белков не приводит к такому эффекту. Ведь половина массы мембраны приходится на белки, а фосфатидилхолин составляет менее половины массы наружного липидного монослоя бислойной плазматнческой мембраны.
Этот результат свидетельствует о том, что липидный бислой определяет целостность мембраны, причем гидрофильные полярные группы играют наиболее существенную роль в образовании стабильной бислойной структуры. (Кстати, не все ферменты типа фосфолипазы С вызывают гемолиз. Некоторые из них не действуют на фосфолипиды в интактных мембранах главным образом потому, что чувствительные к их действию связи пространственно недоступны.) 6-5 А. Только фосфатилилсерин и фосфатидилэтаноламин содержат ами ногруппы, которые могут взаимодействовать с Б1ТБ. Поскольку эти фосфолипиды могут быть помечены только после того, как 6-4 А.
Фосфолипаза расщепляет фосфатидилхолин на фосфорилхолин Ппааматическаа мембрана 313 эритроциты станут проницаемыми (в процессе превращения в ютени»), они, по-видимому, располагаются во внутреннем монослое. Это заключение подтверждается результатами опытов со змеиным ядом, который разрушает фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин только в тенях. Все это показывает, что данные фосфолипиды локализованы почти исключительно во внутреннем монослое мембраны эритроцитов. Разрушение фосфатидилхолина и сфингомиелина фосфолипазой в живых, неповрежденных клетках свяшетельствует о том, что эти два фосфолипида размещаются в наружном монослое.
Это справедливо, если эритроциты действительно остаются интактными при такой ферментативной обработке. В этих опытах по использованию змеиного яда отсутствие деградации фосфатидилсерииа и фосфатидилэтаноламина в интактных клетках служит внутренним контролем. В отношении эффекта сфингомиелиназы внутреннего контроля нет, но отсутствие лизиса клеток указывает на то, что мембрана остается неповрежденной.
Результаты, приведенные в табл. 6-2, не исключают возможности того, что фосфатидилхолин и сфингомиелин локализованы во внутреннем монослое. Однако судя по количеству сфингомиелина, расщепленного сфингомиелиназой, почти весь сфингомиелин находится в наружном монослое мембраны. Для фосфатидилхолина таких данных нет, таким образом, было бы неправильно считать, что фосфатидилхолин локализован исключительно в наружном монослое. Б. Вы выбираете эритроциты для этих экспериментов, поскольку в них нет внутренних мембран. Если бы такие опыты проводились на клетках, у которых есть внутренние мембраны, то нельзя было бы непосредственно определить фосфолипидный состав внутреннего монослоя, поскольку фосфолипиды внутренних мембран могут оказать маскирующее влияние.
Лвтератураг Вгемсаег, М. Аяупппегг!са1 йргй Ьг!ауег я!гас!иге гог Ь1о1оя1са! пгегпЬгапея. Хагпге Хеп Вю1. 236: 11 — 12, 1972. 17еепеп, 1,. 1.. М., 77ебгег, /. 1яргбя ог гйе гег1 сей пгепгЬгапе. 1и ТЬе нег! В!оог! Се!1 (17. Мас1Я1. Бпгяепог, ег1.), рр. 147 — 211, Асаг1еппс Ргем, гчегч УогК, 1974. 6-6 А. Разница в скоростях снижения величины сигнала ЭПР— это результат различия в расположении нитроксильного радикала в двух фосфолипидах.
В фосфолипиде 1 нитроксильный радикал находится на его полярной голове и, следовательно, в непосредственном контакте с внешней средой. Таким образом, он может легко и быстро взаимодействовать с аскорбиновой кислотой. В фосфолипиде 2 нитроксильный радикал присоединен к цепи жирной кислоты и поэтому частично замаскирован в глубине мембраны. Вследствие этого он менее доступен для действия аскорбиновой кислоты и восстанавливается медленнее. Б.
Ключевой результат состоит в том, что степень снижения величины сигнала ЭПР в присутствии и в отсутствие аскорбиновой кислоты в опытах с вновь замкнутыми тенями эритроцитов одна и та же, а в опытах с неповрежденными эритроцитами — нет. Из этого следует, что в цитоплазме эритроцитов есть некий восстанавливающий агент, который восстанавливает более доступный фосфолипид 1, но не может восстановить менее доступный фосфолипид 2. Поэтому в интактных эритроцитах фосфолипид 2 стабилен в отсутствие аскорбиновой кислоты, а в ее присутствии спин-меченые фосфолипиды в наружном монослое восстанавливаются, что 314 Глава б приводит к потере половины сигнала ЭПР. С другой стороны, фосфолипид 1 не стабилен в интактных эритроцитах в отсутствие аскорбиновой кислоты, потому что фосфолипиды во внутреннем монослое доступны действию восстанавливающего цитоплазматического агента, который снижает сигнал ЭПР наполовину.
При добавлении аскорбиновой кислоты меченые фосфолипиды в наружном монослое также восстанавливаются, вызывая потерю остального сигнала ЭПР. В. Результаты, представленные на рис. 6-3, позволяют заключить, что меченые фосфолипиды были введены в оба монослоя плазматической мембраны эритроцитов в равных количествах. Фосфолипид 2 был на 50% чувствителен (доступен) к действию аскорбиновой кислоты, что указывает на присутствие половины метки в наружном монослое, и на 50% нечувствителен, т.е. другая половина метки, не подверженная действию аскорбиновой кислоты, находилась во внутреннем монослое. Количество фосфолипида 1, чувствительного к цитоплазматическому восстанавливающему агенту, составляло 50% от его общего количества, следовательно, половина метки находилась во внутреннем монослое.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
