В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 97
Текст из файла (страница 97)
При этой окраске используют краситель Гимзы, который равномерно прокрашивает хромосомы по всей ~нине, что дает возможность идентифицировать хромосомы и оценить их количество в препарате. Этот метод окраски успешно применялся до 70-х годов прошлого века и позволил выявип этиологию большинства хромосомных синдромов, характеризующихся изменением количества хромосом.
В настоящее время сплошное окра- палка IО Илглмяткгллн лн и нилныгмнк и чнкгил шивапис применшог, и основном, для ныянления количественных аномалий кариотипа, а также специфического свята ломкости при синдроме фрагильной Х- хромосомы. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных по всей длине, представ- Рис. 19.6.
Методы окраски хромосом человека. лен парис. 19.6, а. а — рутинная окраска препарата метафазных хромосом; Однако использова- в — препарат метафаэных хромосом, окрашенных по цние рутинного метода методУ(фотографии предоставлены в г Антоненко1 окраски не позволяет выявлять структурные перестройки хромосом. В зтих случаях применяют специальн ые методы, так называемой, дифференциальной окраски, в результате которой хромосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и толщина темных и светлых полос строго индивидуальны для каждой хромосомы, что позволяет про~юдить их точную идентификацию и выявлять структурные перестройки.
Для объяснения возникновения различно окрашенных полос на хромосомах выдвшвется несколько ~ ипотез: различия в количественном содержании А — Т- и Π— С-пар оснований, особенностии строения нуклеосом, а также асинхронность репликации различных участков ДН К. Наибольшее распространение получил простой и зффективный б-меглод дш/~ференяиальлого охришивалия. В зтом случае для окрашивания хромосом также используют краситель Гимзы, однако, хромосомы предварительно обрабатывают раствором трипсина. Процедура окрашивания занимает от 5 до 10 минут и приводит к пошгаению специфичного для каждой хромосомы рисунка поперечной исчерченности.
Показано, что количество полос в метафазных и прометафазных пластинках существенно различается: в метафазных пластинках их число достигает 400, а в промешфазных — от 800 до 1000. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных ~ ю О- методу, представлен на рис. 19.6, б. Другие методы окраски используются реже вследствие их сложности или у гной специфичности. Я-мегпод обусловливает сегментацию хромосом, противоположную той, которая имеет место при окраске О-методом.
С-хгегпод дифференциальной окраски позволяет анализировать лишь некигорыс районы хромосом — участки так называемого конститутивного гетерохро мати па, локализованного в околоцентромерных областях длинных плеч хромосом 1, 9 и 16, > длинном плече т'-хромосомы, а также в коротких плечах акроцентрических хромо сом.
Для дифференциальной окраски хромосом могут использоваться флуорохромы акрихин, акрихин-иприт, квинакрин и другие 10-меглод окраски). По резулшвшх дифференциальной флуоресцентной окраски идентифицируют каждую пару гомо логов, а по свечению г'-хроматина определяют наличие г'-хромосомы в интерфазш и ядре. Ца<ткь II. Медицинская генек<ика 400 Третий этап исследования кариотипа человека заключается в световом микроскопировании фиксированных и окрашенных пре< ~аратов метафазных хромосом, Для адекватного выявления хром осомных аномалий необходимо проанализировать не менее 30 метафазных пластинок, В том случае, если предполагается мозаицизм по хромосомным аномалиям, количество анализируемых хромосом должно быть увеличено.
Число клеток (п) необходимых для анализа с целью определения заданного уровня мозаицизма можно определить по формуле биноминального распределения: Р = (1 — р)", где р — заданный уровень мозаицизма, Р— вероятность обнаружения мозаицизма. Учитывая, что в различных клетках организма количество нормальных и аномальных клонов может различаться, для выявления мозаи цизма может потребоваться анализ нескольких тканей, например, клеток крови, фибробластов, половых желез.
19.4Л.З. МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД В ряде случаев использование традиционного цитогенетического метода не позволяет идентифицировать все имеющиеся хромосомные перестройки, особенно если в пих вовлечены более двух хромосом или они захватывают очень малый по размеру участок. Для этих целей в последние годы разработаны новые высокоинформативщ <е молекулярно-цитогенетические методы, главный из которых флуоресцентная гибри<)изацик ьз з<ги, или так называемый р)зН-цел<од (от англ. ))иогезсепг ие з)ги )<уй<«))га«ик).
С помощью этого метода можно проводить гибридизацию метафазн ых или интерфазныххромосом с различными ДНК-зондами, меченными флуоресцирук>шими веществами (гл. 18), Зонды представляют собой клонированные последовательности или вьщеленные участки ДН К. Наиболее часто используют высокоповторяющиеся последовательности ДНК центромерных или перицетромерных районов, однако, в ряде случаев возникает необходимость в применении уникальных ДНК- последовательностей, таких как космидные клоны или анонимные последовательности. С их помощью удается не только идентифицировать различные типы структурных хромосомных перестроек, но и провести более тонкий генетический анализ (например, Идентифицировать точки разрыва при транслокациях, инверсиях, делециях, а также структуру маркерных хромосом).
В некоторых случаях, особенно при возникновении сложных транслокаций с во<влечением нескольких хромосом, возникает необходимость использовать в процессе гибридизации большое число флуоресцирующих ДНК-зондов, которые иногда прокрашивают хромосому практически целиком. Такую модификацию Р13 Н-метода называют еулреесорной гибридизацией. Для успешного осуществления этих методов созданы специальные библиотеки хромосомоспецифичных участков ДНК. В последние годы при проведении Р1БН-анализа все чаще используют ДНК-зонды, меченные различными цветами, Применение разноцветных зондов позволяет более быстро и эффективно провести анализ количественных и структурных перестроек хромосом, особенно, в случае пренатальной экспресс-диагностики.
401 Глаии Гй Ниеледетиеиииеии, и иииими пи чели . 19.4Л.4. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ НОРМАЛЬНОГО КАРИОТИПАЧЕЛОВЕКА Для описания нормального кариотипа человека, а также для обозначения структурных и количественных перестроек хромосом используется определенная универсальная схема и специальные символы. Описание кариатида начинают с указания общего количества хромосом в клетке, после чего ставится запятая и обозначается набор половых хромосом, указывающий на пол обследованного. Например, запись 46,ХХ характеризует нормальный кариотип женщины, а 46,ХУ вЂ” нормальный кариотип мужчины.
Если хромосомных перестроек у обследованного не выявлено, то запись на этом заканчивается. В ряде случаев, при обследовании обнаруживают, так называемый, нормальный полиморфизм хромосом — индивидуальные особенности их строения. Полиморфизм наиболее характерен для акроцентрических хромосом и, как правило, отражает вариабельность размеров гетерохромати новых сегментов, наличие спутников и спутничных нитей в области коротких плеч и их величину (рис. 19.7).
Иногда в качестве вариантов нормального кариатида рассматривают наличие ломких сайтов хромосом, часто выявляемых при культивировании в определенной среде. В большинстве случаев наличие полиморфизма строения хромосом не приводит к возникновению патологических симптомов у их обладателя. Отсутствие патологических последствий при увеличении размеров гетерохроматиновых блоков хромосом можно объяснить особенностью строения гетерохроматина. Показано, что в ега структуру входит ДНК с многократно повторяющимися последовательностями, количественные изменения которой не приводят к существенному генному дисбалансу.
Кроме тога, считается, что некодирующая сатгелитная ДНК гетерохроматиновых районов некоторых хромосом может способствовать повышению уроищ функционирования генома, Необходимо отметить, что иногда наличие нормального полиморфизма хромосом, все-таки увеличивает риск рождения ребенка с храмосомными аномалиями. Рис. 19.7. Нормальный полиморфизмакрацентрических хромосом (группа О или О) человека.(Из: Фогель Ф., Мотульски А,!989) а — нормальные хромосомы из групп О и Е (18- хромосома); б — Орж — удлиненные короткие плечи хромосомы из группы О (их длина такая же как у хромо- сомы 18); Ор+з — на удлиненных коротких плечах расположеныы спутники нормальных размеров; и — О-хромосомы со структурными вариантами спутничнагарайана: ач — двойные спутники; з+ — увеличенные спутники; згlг — удлиненные спугничные нити Чиспел У, Медининскин ррпппеики $02 тибпини 19.2. Обозначение нолнморфнзма хромосом человека Спмпопм пприотипи тип хромосомное перестрелки Существуют данные, свидетельствующие о том, что среди супружеских пар, у которых наблюдалось рождение детей с пороками развития, а также страдающих бесплолисм и привычным невынашиванием беременности, статистически значимо чаше вьппшяется носительство хромосом с крупными гегерохроматиновыми блоками.
11рсобладание лиц с увеличенными в размере гетерохроматиновыми сегментами в акро~ ~ецтрических хромосомах, а также хромосомах 1, 9 и 16, отмечено в группе дезой с множественными врожденными пороками развития невыясненной зтиологии и олигофренией. Обозначения основных вариантов полиморфнзма нормального кариотипа человека представлены в табл. 19.2. Достаточно часто в популяции здоровых людей при цитогенетическом анализе выявляется заметное увеличение коротких плеч некоторых хромосом (например, хромосомы 15) Изучение нормального полиморфизма хромосом может иметь знавшие для определения родительского происхождения хромосомной перестройки.
Гели установлено, от кого из родителей унаследован полиморфизм хромосом, то зто указывается при записи кариотипа. Например, запись 46,ХХ,15рз+ра1 означает, что же~ ивиной от отца унаследованы увеличенные спутники на хромосоме 15, а запись 46,ХУ,16 е))з+ гпа1 указывает на материнское наследование увеличенного в размере ~стсрохроматина хромосомы 16. 19.4.2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ Характерные изменения биохимических показателей, выявляемые при той или иной наследствещюй патологии, служат постоянным, а иногда и единственным признаком заболевания. Кроме того, отклонения в биохимических параметрах, как правило, ~ ~рсдшествуют возникновению клинических симптомов, и существенно не зави- 46,ХХ,9е1Ь- 46,ХУ,Уе1Л— 46,ХХ,22рзч- 46, ХУ, 21рп)» 46, ХХ,)гаП 6) (е121.3) 46,ХХ,15рзз 46,ХХ,21рзч- Увеличение размера гетерохроматинового участка в длинном плече хромосомы 9 женщины Уменьшение размера гетерохроматииового района на длинном плече У хромосомы мужчины Увеличение размера спутников на коротком плече хромосомы 22 у женшины Увеличение длины спугничных нитей на коротком плече хромосомы 21 у мужчины Ломкий сайт в сегменте 21 длинного плеча хромосомы 16 Появление двойных спутников на коротком плече хромосомы 15 у женщины Увеличение размера спутников на коротком плече хромосомы 21 у женшины Гяияа Гй Нислгдстяенвкть и яаталпгия чглаа 403 сят от клинико-генетического полиморфизма, обусловливающего вариабельносгь заболевания по степени тяжести и времени начала манифестации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
