В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 96
Текст из файла (страница 96)
Наилучший подход, позволяюший избежать осложнений, вызванных генетической гетерогенностью,— это работа с одной родословной, достаточно большой для проведения анализа сцепления. Проводя анализ такой родословной с моногенным заболеванием, можно быть уверенным в идентичности генного локуса у больных. Другой подход к эффективному анализу сцепления состоит в изучении отдельной изолированной популяции (этнического, социального, или географического изолята). В этом случае высока веро- Глава Гй Наорав% ппввпппи пп и пиппмпгпи иппиипл и ятностьзмпх гп1 мупвпвь имевшая мсщо уолшно из«основателей» популяции, получила распрострш ил ~не в рамках ~ыпл юго юолгг1а и все больные да иым заболеванием в ~юпулш сии ящщются потомками одного и того же человека.
Еще олин способ оптимизации ге~ юм~ юго скрини ига — анализ сцепления с локусами генов-кандидатов. Геном-кандидатом называют ген, продукт экспрессии которого может прямо или косвенно участвовать в развитии изучаемой болезни. Весьма ~ щодотворным для поиска генов-кандидатов оказался подход, заключающийся в исслсловании генов, мутации в которых приводят к сходной патологии у трансгенных животных. Например, ген Ебй2 был предложен в качестве гена-кандидата для тяжелыхх форм демиелинизирующих нейропатий на основании наблюдавшейся демиелии изаци и нервных волокон в онтогенезе у мышей, нокаутных по этому гену.
Анализ сцепления заболевания с полиморфными маркерами из области локализации генов-кандидатов в семьях предпочтительнее, чем скрининг известных генон на наличие мутаций у отдельных пациентов, поскольку позволяет избежать ошибок, связанных с методами регистрации мутаций (гл. 18). Таким образом, различные варианты поиска сцепления могут быть успешно применены в каждой конкретной ситуации.
19.4. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 19.4.1. МЕТОДЫ КАРИОТИПИРОВАНИЯ 19.4.1,1. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА Набор хромосом человека, находящихся в ядре соматической клетки, называют кариотияом. В 1956 г. шведские ученые Дж. Тио и А Леван убедительно доказали, что число хромосом во всех клетках человека, кроме половых, равно 46. Этот набор хромосом назьваюг дпплопдиым (парным). В половых клетках человека хромосом вдвое меньше — 23, т.е.
эти клетки гаплоидны. При оплодотворении диплоидностыюсстанавливается (см. гл. 2). Схема строения хромосомы представлена на рис. 19.4. В хромосоме вьщеляют короткое (р) и длинное (с)) плечо. Концы обоих плеч хромосом называют ееломерами. В митозе хромосомы представлены двумя сестринскими хроматидами, соединенными центромерой. Показано, что в центромере содержится вещество — кинетохор, участвующее в формировании нитей веретена при клеточном делении.
396 Части П. Мя)ииинекан генетика 11.32 11.23— 11.2!в 11.!в 1г.1 — г1.! — 21.3! — г1.33 гз Основы существуюгцей унифицированной классифи ка лии хромосом были заложены в 1960 г. вДенвере. Восновуклассификации положены различия в длине хромосом и расположении центромеры. На основании различий в длине выделены 23 пары хромосом, при этом парам, имеющим наибольшую длину, дан наименьший — 11 2 номер (самыми длинными являются хромосомы 1- и 2-й пары).
Выделяют группы метацентрических, субметацентрических и акроцентрических — 12.2 хромосом. Отнесение хромосом к тому или иному типу производится на основе расчета центро- мерного индекса — отношения длины короткого г).г— плеча к длине всей-хромосомы. В группе мета21зг— центрических хромосом короткое и длинное гг.!в плечи приблизительно равны, и центромерный — 22.2 индекс приближается к 0,5. В субметацентриче- 22.3— ских хромосомах центромерный индекс снижен и составляет от 0,25 до 0,35, в акроцентрических хромосомах он часто не превышает 0,2.
На основании комбинации этих двух основных признаков хромосомы сгруппированы в 7 групп, обоРис. 19.4. Строение хромосомы значаемых буквами английского алфавита (от А до О). Группа А включает хромосомы 1, 2, 3, причем хромосомы 1 и 3 — метацентрики (центромерный индекс первой хролюсомы равен 0,48 — 0,49, третьей — 0,45 — 0,46), а хромосома 2 — самый большой субметацентрик (с центромерным индексом 0,38-0,40). Группа В состоит из двух хромосом — 4 и 5. Это большие субметацентрические хромосомы с центромерным индексом от 0,24 до 0,30.
Группа С включает семь аутосо м (с 6 по 12) и половую Х-хромосому. Это метацеив трические и субметацентрические хромосомы среднего размера (0,28 — 0,43). 1йунна Р включает три акроцентрические хромосомы среднего размера: 13, 14 и 15. Их центромерный индекс не превышает 0,15 и является наименьшим в кариоти~~с человека. Для хромосом этой группы характерна значительная межиндивндуальнвя вариабельность и наличие спутников на коротких плечах. Длина проксимальных участков коротких плеч и спугничных нитей варьирует.
Группа Е также включает три хромосомы — с 16 по 18. Это относительно короткие метацентрики и субметацентрики, с центромерным индексом 0,26 — 0,40. 1дунна Е состоит из двух небольших метацентрических хромосом (19 и 20) с ценнромерным индексом 0,36 — 0,46. /руина 6 состоит из двух аутосом (21 и 22) и У-хромосомы.
Эти хромосомы имеют небольшой размер и относятся к акроцентрическим с центромерным индексом в ~ пределах 0,13 — 0,33. Для аугосом этой группы характерно наличие спутников на коротких плечах. ЗЧ7 /аппп уй Ниследетеелптть и паттеепю па ~ ГРуппа А 1 2 3 Р Группа В 4 5 Р 0 1З 0,48 0,39 0,47 0,29 ГРуппа С' 6 7 Х Группа С"' 1О 11 12 Группа С" 8 9 3З .$ 3 0,34 0,35 0,34 0,40 0,30 Группа Е 16 17 18 0,39 0,40 0,39 33 . й 0,41 0,34 0,31 0,17 0,19 0,20 Группа й 21 22 У Группа Р 19 20 3~Л 0,46 Рис.
19.5. Хромосомы человека (группы, схема сегментации, центромерный индекс) В настоящее время Денверская номенклатура постепенно вытесняется более детальной классификацией, основанной на результатах исследования хромосом молекулярно-цитогенетическими методами. Расположение хромосом по группам и схема их сегментации (расположение полос поперечной исчерченности при дифференциальном окрашивании) в соответствии с номенклатурой 1ЯСМ-1995 представлены на рис.
19.5, Р 0 3 М : 3 Ф 3 зйв Часть!1 Медииинскоя еенетина 19.4.1.2. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД Анализ кариотипа человека проводят в культуре делящихся соматических и половых клеток, Наиболее часто при цитогенетических исследованиях в медицинской геиетике используют культуру клеток периферической крови, прежде всего лимфоцитов, костного мозга и фибробластов.
Наиболее доступны для исследований лимфоциты периферической крови, которые, в большинстве случаев и служат объектом цитогенетического анализа у человека в постнатальном периоде. Для анализа кариотипа плода могут быть использованы различные клеточные культуры; их выбор диктуется сроком беременности, в котором проводится исследование. Так, на раннем сроке (до 12 недель внутриутробного развития) анализ хромосом целесообразно проводить в клетках ворсин хориона, в то время как в более позднем сроке цитогенетическому исследованию подвергают клетки плода, выделенные из амниотической жидкости, пуповинной крови и плаценты 1гл, 25). Для исследования кариотипа человекадостаточно получить образец периферической крови в количестве ! — 2 мл.
Цитогенетический анализ включает три основных этапа; 1) культивирование клеток; 2) окраску иренарата; 3) микросконинеский анализ нренарата. Культивирование клеток проводится следующим образом. После забора образец крови помешают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений — фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток. Успех цитогеиетического исследования в значительной мере определяется тем, сколько клеток в культуре будут нахошпься в стадии метафазы. Для увеличения количества метафазных клеток за полтора часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин, который разрушает клеточное веретено, приостанавливает деление клеток на стадии метафазы и увел ичивает конденсацию хромосом. Обычно, продолжительность культивирования составляет 72 ч.
После его окончания клетки с питательной средой центрифугируют и помешают в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия. Гипотоническая обработка приводит к разрыву ядерной оболочки и межхромосомных связей и свободному перемещению хромосом в цитоплазме. После этого производится фиксация клеток смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, после чего клеточную суспензию раскапывают на охлажденные влажные предметные стекла и высушивают на воздухе. На следующем этапе цитогенетического исследования производится окраска препаратов. В зависимости от целей исследования, то есть от того, какой именно тип перестроек необходимо выявить, можно использовать различные виды окрашивания. Наиболее простой метод окрашивания хромосом, называемый в настоящее время сплошным или рутинным, применяют для определения количества хромосом в препарате и выявления геномных мутаций и анеуплоидий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
