С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Вследствие этого трансдуктанты„возникающие при множественности инфекции, равной 1 (одна частица на одну клетку), оказываются нелнзогеннымн н не обладают иммунитетом к фату Р1, Дефектность трансдуцнрующнх частиц Р! подтверждает и то, что трансдукцню могут осуществлять даже вирулентные мутанты Р1. Это показывает, что трансдуцирующне частицы действительно не способны инициировать нормальный цикл развития фага.
Иначе клетки, зараженные вирулентным мутантом фага Р1, должны были бы погибнуть. Перенос генов при общей трансдукции может привести к двум различным состояниям трансдуктантов. В одних случаях привнесенный ген наследуется стабильно, поскольку интегрирует с хромосомой реципиента. Это полная грансдукцил.
В других случаях при аборгианой грансдукции внесенный фатом фрагмент генома не реплицируется н передается по одной линии при размножении трансдуктанта, т. е. иэ двух клеток — потомков каждого деления — лишь одна получает трансдуцированный ген. Так, в частности, можно трансдуцировать ген, определякзщий наличие жгутика у Я. Гура!вгик!пят. В атом случае во всем клоне — потомстве трансдуктанта — жгутик, а следовательно, подвижность сохраняет только одна клетка.
Абортивная трансдукция происходит чаще, чем полная, иногда в 10 раз. Рис. 9,7. Отношения умеренного бактериофага и бактериальной клетки: А и Б — литический цикл;  — лизогенизапия; à — полная трансдукцня; Д вЂ” абортиниая трансдукция /т,:т':1 2!! Возможные варианты отношений между умеренным бактериофагом н клеткой при общей трансдукции показаны на рис.
9.7. Специфическая трансдукция отличается от неспецифической тем, что бактериофаг может переносить только определенные гены, как зто характерно для фага л Е. со10 который может трансдуцировать только гены локуса ха1, ответственного за усвоение галактозы, и Ыо — гены синтеза биотина. Явление специфической трансдукцни открыли в 1956 г. М. Морзе и супруги Э. и Дж. Ледерберг. Умеренный бактериофаг Л при лизогенизации Е. соВ интегрирует в ее хромосому на участке между покусами да1 и Ыо.
Это было показано в конъюгационных скрещиваниях лизогенных Н1г и нелизогенных Р -бактерий. Ои1«-трансдуктанты возникают обычно с частотой 1Х 10 ' — 10 ' и, как правило, генетически нестабильны. Они выщепляют клетки Оа1" ' с частотой около 2 Х Х 10 ' на клеточное деление. Это явление обаясняется тем, что трансдуктанты Оа1+ частично гетерозиготны Ва1!8аГ», т. е. несут дополнительный фрагмент 8а1«вместе с участком 8а1 реципиента. Такое состояние называется гегерогеиотой.
При облучении гетерогенот ультрафиолетовым светом удалось получить фаголизаты, способные к трансдукции с очень высокой частотой. Почти половина всех частиц Л могла передавать признак Ои1« при трансдукции. Изучение фатов из таких лизатов, названных НЕТ (от англ. 1з18Ь 1гейиепсу угапзопсйоп), показало, что гены яа1 переносят так называемые дефектные фаги Л, т, е. такие, которые, лизогенизируя бактерии, сообщают нм устойчивость к суперинфекции Л, но в дальнейшем лизогенные бактерии не способны продуцировать инфекционные частицы бактериофага.
Дефектные трансдуцирующие частицы Л, обозначаемые Л йа1, не образуют стерильных пятен на газоне Е. соИ. Они не могут самостоятельно размножаться. Для этого им требуется фаг-помощник: нормальный, не способный к трансдукции. У дефектных фатов Л яа1 от '/«до ' ггз собственного генома замещены на яя1 — участок бактериальной хромосомы, Общая схема лнзогенизации Е.
сой бактериофагом Л и образования трансдуцирующнх частиц представлена на рис. 9.8. Сайт-спецнфнческая рекомбннация, Геном фага Л проникает в бактериальную клетку в линейной форме, однако на концах линейной молекулы ДНК есть так называемые липкие концы— однонитевые участки по 12 нуклеотидов, комплементарные друг другу.
В клетке ДНК Л замыкается в кольцо. В таком виде она интегрирует в геном бактерии. Принцип атой интеграции предло- В обозначении генотипа и фенотипа микроорганизмов приняты трскбукяеи ные сокрашения. При изображении генотипа рецессивные вплели — строчные а доминантные — прописные буквы или строчные со знаком «+». При нзобра1кении фенотипа первая буква прописная, остальные две — строчные; при этом знак «+» нли « — » означает наличие или отсутствие изучаемого свойства.
Так, символ Г«а1 показывает, что клетки бактерии не способны утилизировать галактозу. 2!2 ла /тт й/ да/ апй Ью ° в ~ с Ью /и! ай/Ч/ттОР ОИ Л Р Е// Ьт Есо/!/М/ Р О /лтл/ Ь/о +- Рис. 9.З. Схема интеграции и зксцизни генома бактериофага Х за счет сайт-снецифической рекомбинации с хромосомой П. сов и образование трансауцирукчцих частиц жен А.
Кэмпбеллом в 1962 гс кольцо генома 2 реципрокно рекомбинирует с кольцом бактериальной хромосомы. Один обмен приводит к интеграции ДНК фага 2 с ДНК бактериальной хромосомы. В дальнейшем оказалось, что интеграция профага может происходить только в одном месте на хромосоме Е. со(/, названном а// ). (апас1ппеп! зпе 2). Аналогичный участок есть в геноме бактериофага.
При этом рекомбинация происходит в отсутствие протяженной гомологии. Общим у фага и бактерии оказался участок всего в 15 п. н.: ...ОСТТТТТТАТАСТАА... (показана только одна цепь ДНК) Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы осуществляется по тому же механизму реципрокной, сайт-специфической рекомбинации (рис. 9.3). Как интеграцию, так и эксцизию профага контролируют два фаговых гена: /и/ и х/ж 2! 3 Сайт-специфическая рекомбинация происходит точно, но не безошибочно.
Приблизительно один раз на 1 млн. при эксцизии профага рекомбинация осуществляется не в ан-сайте, а захватывает участки яа1 или Ь(о. Так возникают трансдуцирующие частицы, у которых часть генетического материала профага замещена генами бактерии (рис. 9.81. Во всех этих случаях в оекомбинацию вовлекаются те же последовательности из 15 пар нуклеотидов, которые встречаются в генах да( и Ь(о. За пределами этих 15 и. н.
гомология отсутствует. Очевидно, что механизм сайт-специфической рекомбинации резко отличается от механизма кроссинговера, рассмотренного в гл. 7. Сайт-специфическую рекомбинацию проводит фермент интеграла, кодируемый локусом тг фага 2. 9.4. Генетический анализ у бактерий Генетический анализ у бактерий основан на использовании процессов, ведущих к рекомбинации: конъюгации, трансформации, трансдукции, а также на переносе генетического материала помощью плазмид — Е-факторов, факторов устойчивости и др.
При конъюгации в клетку-реципиент переносится обычно меньше половины бактериального генома, и очень редко весь геном. При трансдукции размеры переносимого фрагмента определяются емкостью оболочки бактериофага, но они не превышают 1/100 длины хромосомы Е.
соИ, т. е. составляют участки до 3„2 Х Х 10" п. н. При трансформации фрагменты, включаемые в геном бактерий, имеют сопоставимую длину: от 1,5 до 20 Х 10' п. н. Таким образом, «зигота» бактерий всегда является частичной зиготой или мерозигогои. Конкретные задачи генетического анализа диктуют выбор того или иного метода введения генетического материала в клетки- реципиенты. Так, прерываемая конъюгация позволяет установить последовательность генов на хромосоме.
Однако этот метод неудобен при картировании маркеров, разделяемых 1 — 2 мин карты. В этих случаях необходимо картирование по трем точкам, которое проводят как на основе конъюгации, так н на основе трансдукции или трансформации. Для интеграции линейного фрагмента, внесенного в клетку, требуется двойной кроссинговер с кольцевой хромосомой. При конъюгационном картировании предварительные данные о грубой локализации исследуемого гена с помощью прерываемой конъюгации позволяют выбрать селективный маркер, по которому отбирают рекомбинантов.
Такой маркер должен находиться за пределами исследуемого участка — дистально по отношению к точке начала переноса бактериальной хромосомы. При этом исследуемый ген или гены вводятся с фрагментом хромосомы Н/г. Клетки Р" должны также иметь селективный маркер (например, устойчивость к стрептомицину), для того чтобы отбирать клетки- реципиенты, в которых и происходит рекомбинации.
Предположим, что прн скрещивании Н/г АВС Х Е иЬс селек- зм Ф л', ' го' о е с 5Ф 9'К гае ег' „егль оаг.19\ срг.Ге е 'г ге ага.1 мега Гго.1Д2О риг.а гич 7 >'. г а .гозв оет 9" 6' ог н я е уе ъ о -Й 4 Рнс. 9.9. Генетическая карта Лыгомиго 7еаиойноаоииг (оо и Вег1оаег ег а1., 19781 215 тивным маркером служит ген А и при этом неселектируемый ген В обнаружен у 95 % рекомбннантов, а ген С вЂ” у б0 %, Это указывает, что частота рекомбинации между А и В составляет 5 %, а между А и С вЂ” 40 %.
Так же можно установить частоту совместного наследования В и С среди рекомбинантов по гену А— 35 %. Таким образом, порядок расположения генов А —  — С и расстояния между ними аддитивны. Сравнение физической карты Е. со!г, построенной в опытах по прерыванию конъюгации, н рекомбинационной карты показывает, что 1 мин соответствует 20 единицам рекомбинации. Поскольку вся хромосома передается за 100 мин, ее общая рекомбинационная длина составляет 2000 единиц, а с учетом общего количества ДНК в хромосоме (4 109 и.
н.) единица рекомбинации соответствует ок. 2 тыс. п. н. Расчеты показывают, что рекомбинационное картирование разумно применять на расстояниях не более 3 мин, поскольку на больших расстояниях маркеры будут наследоваться независимо. Прн использовании конъюгационного метода трудно ставить реципрокные скрещивания. В связи с этим картирование на коротких участках обычно проводят с использованием трансдукцни при помощи умеренною фага Р1.
Об относительном расположении маркеров при трансдукции судят по частоте совместного включения маркеров в частицу бактериофага (когрансдук9ии) при селекции трансдуктантов по одному из них. Аналогичные данные можно получить при трансформации. Трансформацию и трансдукцию, а также учет частот рекомбинации при конъюгации обычно применяют для картирования на коротких участках бактериальной хромосомы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
