Д.С. Орлов - Химия почв (1114534), страница 59
Текст из файла (страница 59)
Гумусовые кислоты сильно варьируют по элементному составу, в связи с чем меняются и множители или их вообще не удается подобрать без грубогоокругления. Это естественное следствие гетерогенности гумусовых кислот. Поэтому удобно рассчитывать нижний допустимый предел молекулярных масс, считая, что молекула ГК или ФК содержит один илинесколько атомов азота. Пример такого расчета приведен в табл. 57.Т а б л и ц а 57Средние простейшие формулы и средние минимальные молекулярныемассы гумусовых кислот главнейших типов почвПочваМолекулярные массы при числе атомовазота, равномПростейшиеформулы13|4Гуминов ые кислотыТорфяно-болотнаяПодзолистаяСерая леснаяЧерноземСероземC 2 oH 2 i0 8 NC16H1708NC16H1708NC18H1508NCuHr*07NПодзолистаяЧерноземСероземC 17 H 20 O I3 NC 1 4 H 1 9 0, 2 NC13H19012N403351351373308420910531053111992416121404140414921232133811791143178415721524Фульв окислоты446393381Найденные таким способом минимальные молекулярные массыопределяют нижнюю границу возможных реальных молекулярныхмасс.
Если, например, для фульвокислот минимальная масса равна400—450, то найденные экспериментально значения порядка 200—300следует признать явно ошибочными, причем этот вывод сделан придопущении, что молекула содержит только один атом азота. Однакоустановлено, что азот гумусовых кислот находится по крайней мере втрех принципиально различных положениях: в форме легкогидролизуемых соединений (аминокислоты и аминосахара), в форме гетероциклови в составе негидролизуемого остатка.
Считая тогда, что число атомовазота в молекуле не может быть меньше трех, получим, что минимальная молекулярная масса гумусовых кислот должна быть утроенаи составлять величины порядка 900—1400. Меньшие значения невозможны ни для среднечисловых молекулярных масс, ни для структурных ячеек.Определение молекулярных масс методом светорассеивания. Зависимость между средневесовой молекулярной массой вещества и его-светорассеивающей способностью может быть выражена в общей форме уравнениемКС1ммS*+_В_С>RT227где С — концентрация вещества; ММ — его молекулярная масса; К иВ — константы; /?эо — относительная интенсивность рассеяния светапод углом 90°.Построение графика в координатах KC/RQQ — С позволяет найтиискомую молекулярную массу: отрезок, отсекаемый на оси ординат,обратен величине молекулярной массы.
Для гуминовых кислот методсветорассеивания дает хорошие результаты, но большое влияние нарезультаты измерения интенсивности рассеянного света оказываютмалейшие загрязнения раствора и даже отдельные пылинки. Тщательность очистки растворов перед опытом — главное условие, определяющее успех эксперимента. Методом светорассеяния найдены средневесовые молекулярные массы для гуминовых кислот дерново-подзолистойпочвы, равные 65 800, и гуминовой кислоты чернозема — 66 200.Гель-фильтрация гумусовых кислот. Сущность метода гель-фильтрации заключается в пространственном разделении молекул различных размеров с помощью пористых гелей. Молекулы, размеры которыхмалы по сравнению с порами геля, свободно диффундируют во всемобъеме геля; крупные молекулы в поры не проникают и остаются вовнешнем объеме растворителя, расположенном между отдельными гранулами геля.
Фракционирование осуществляют в вертикальной колонке, заполненной гранулами пористого геля.Специально для целей гель-хроматографии создано несколько типов гелей, из которых в химии гумусовых кислот наиболее распространены сефадексы. Сефадекс — это декстрановый гель, получаемый наоснове полисахарида, продуцируемого особого вида бактериями.Колонка для гелевой хроматографии (рис. 45) содержит набухшие гранулы геля, а пространство между гранулами и поры геля заполнены растворителем. Колонка характеризуется следующими величинами. Объем матрицы, или объем сухого геля, обозначают Vm.Объем растворителя внутри гранул («связанный» растворитель) называют внутренним объемом и обозначают V,-. Объем растворителя между гранулами («свободный» растворитель) называют внешним объемоми обозначают VQ.
Понятно, что общий объем геля Vt=Vm+Vi+ VoВ поверхностный слой колонки вводят раствор гумусовой кислоты.Если препарат гумусовой кислоты содержит молекулы хотя бы двухтипов, различающихся по размерам, то они будут неравномерно распределяться между гелем и растворителем. Молекулы меньшего размера свободно проникают в поры геля; крупные молекулы остаютсятолько во внешнем, по отношению к гелю, объеме раствора (см.рис. 45, А). Молекулы меньших размеров также находятся и во внешнем объеме раствора, но их доля в этом объеме значительно меньше,чем в исходном веществе, и зависит от соотношения Vt и VoПромывание колонки растворителем вызывает вертикальное перемещение молекул вдоль колонки.
Крупные молекулы движутся свободно с растворителем, тогда как молекулы меньшего размера в каждомновом слое колонки стремятся распределиться по объему всего геляэтого слоя и вымываются из этого слоя медленнее, чем большие поразмерам молекулы. В результате крупные молекулы движутся по колонке с большой скоростью, тогда как элюирование низкомолекулярной фракции тормозится диффузией молекул в поровое пространствогеля. В результате в толще колонки формируются зоны (слои), содержащие молекулы различных размеров и движущиеся с неодинаковойскоростью (см. рис. 45, В).Вытекающий из колонки раствор (элюат) собирают порциями по2—5 мл, и в каждой порции измеряют оптическую плотность или со228держание углерода.
Чтобы не анализировать каждую порцию раствора, можно пропускать элюат через проточную кювету спектрофотометра и непрерывно автоматически регистрировать оптическую плотностьна специальном бланке. Результаты представляют в виде графика, накотором по оси абсцисс отложен суммарный объем собранного элюата, а по оси ординат — оптическая плотность (или концентрация)каждой порции элюата (рис. 46).0*0 ОООО ООООВОООOQ.©'•:©>©ооOQC91Щ2038116 24 32 40 48 56 64 72т2 3 4 5 6 7 8 9 чРис. 46. Гель-хроматограмма органических веществ щелочного экстрактаиз гор. А красной ферралитной почвыРис.
45. Схема разделения гумусовыхвеществ при гель-фильтрации.А — нанесение образца на колонку;Б — начало движения образца поколонке; В — разделение на фракции; 1 — низкомолекулярные компоненты образца, 2 — высокомолекулярные компоненты образца,3 —гранулы геляВажнейшим показателем, необходимым для вычисления молекулярных масс, служит объем выхода элюата Ve- Это — объем элюата,собранный с момента внесения вещества на колонку и до того момента, когда на кривой появился максимум выхода веществ (максимумоптической плотности). Для глобулярных белков:lgAf=M 0 — (6,062—5,00 d) {Ve/Vo),где М — молекулярная масса, М0 — константа, d — плотность набухшего геля.
Для различных типов сефадексов (G-75; G-100, G-200) этаформула может быть переписана в конкретной форме:для G = 75:\gM = 5,624—0,752для G = 100: lgAf = 5,941—0,847для G = 200: IgM=6,698—0,987(Ve/V0),(Ve/V0),(Ve/V0).229Поскольку изучаемые вещества различаются не только по размерам, но и по форме молекул, а также неодинаково взаимодействуют свеществом геля, то для получения надежных результатов прибегают ккалибровке колонки с гелем по веществам с известными молекулярными массами.Таким образом, полученная кривая элюирования, или гель-хроматограмма, дает полное представление о соотношении молекул (частиц)гумусовых кислот с разными молекулярными массами, или о молекулярно-массовом распределении.
Отдельные максимумы характеризуютприсутствие сравнительно монодисперсных фракций, средняя молекулярная масса которых рассчитывается по Уе. Доля таких фракций всоставе препарата в первом приближении пропорциональна площади,ограниченной кривой элюирования для каждой из фракций.По данным гель-хроматографии, нижний предел молекулярныхмасс гуминовых кислот определяется величинами 5000—6000; меньшего размера молекулы обнаруживаются в небольших количествах только в некоторых типах почв, например в горно-луговых. Верхняя граница лежит в диапазоне 400000—650000, .но крупные частицы встречаются в небольших количествах.
Основная масса вещества приурочена кмолекулам средних размеров с молекулярными массами от 20 000 до80 000.При сравнительной характеристике гумусовых веществ различныхтипов почв наиболее характерным показателем часто является не средняя величина Мю препарата в целом, а его молекулярно-массовое распределение.
Так, в черноземах, серых лесных и близких к ним почвахмолекулярно-массовое распределение частиц гуминовых кислот болеекомпактное, а среднее значение Мш несколько ниже, чем в дерновоподзолистых и гидроморфных почвах. Для последних характерна резкая дифференциация частиц ГК. по молекулярным массам, и в составегуминовых кислот обнаруживаются фракции как с минимальными,так и с наиболее высокими молекулярными массами.Фульвокислоты всех типов почв, по данным гель-фильтрации, представлены одной или двумя фракциями с молекулярными массами10 000—15000 и 4000—6000.Электронно-микроскопические наблюдения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
