Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1112199), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Последнюю растворяют в фосфатном зз буфере рН 6,5 — 7,0 (см. главу 21) в концентрации 0,2 мгlмл и в качестве активатора добавляют хлорид магния в концентрации 0,2 М. Обработку производят при температуре ЗT С в течение 4 — 6 ч. К фиксации особых требований нет, но не следует употреблять фиксаторы, содержащие ртуть или бихромат.
Приготовление раствора: 5 г хромовых квасцов (К 8О4Сгз ~8О4]„.24 Н О) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, йрйбавляюзт 0„15 г галлоцианина; раствор кипятят в течение 5 мин, охлаждают, фильтруют и фильтрат доводят дистиллированной водой до 100 мл. Приготовленный распюр имеет рН 1,64 и, следовательно, вполне подходит для выявления нуклеиновых кислот. Раствор пригоден в течение длительного времени. Методика проведения реакции: 1)депарафинированные парафиновые срезы из дистиллированной воды переносят в раствор галлоцианина и хромовых квасцов и окрашивают в течение 48 ч при комнатной температуре; 2) промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой; 3) обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
Р е з у л ь т а т р е а к ц и и: нуклеиновыекнслотыокрашиваются в серовато-синий цвет. Выявление а-аминокислот ииигидрииовой реакциеи по Ясума и Ичикава используется как общая реакция на белки. Пригоден материал, фиксированный любым способом. Необходимые распюры: 0,5% раствор нингидрина в абсолютном спирте или 1'4 распюр аллоксана. Методика проведения реакции: 1)депарафинированные срезы переносят из дистиллированной воды в раствор нннгядрина или аллоксана и выдерживают 16 — 24 ч при температуре ЗT С; 2) промывают водопроводной водой в течение нескольких минут; 3) проводят обработку реактивом Шиффа в течение 15 — 30 мин; 4) промывают в водопроводной воде 10 мин; 5) обезвоживают в спиртах, заключают в ксилол, бальзам.
Р е з у л ь т а т: белки окрашиваются в цвета от розового до красно-фиолетового. Окрашивая не гликогеиа методом реактив Шиффа — йодиая кислота. 1ШИК-реакцня) в модификации А. Л. Шабадаша. Метод основан на окислении полисахаридов перйодатом калия или натрия с образованием альдегидных групп, дающих реакцию с фуксинсернистой кислотой. В качестве фиксаторов можно рекомендовать насыщенный раствор пикриновой кислоты в абсолютном спирте, жидкость Карнуа, спирт-формол (на 9 частей абсолютного спирта 1 часть формалина) или фиксатор Шабадаша (спирт 96% 100 мл, нитрат меди 1,8 г, нитрат кальция 0,9 г, формалин 10 мл).
Кусочки материала должны быть тонкими (2 — 3 мм толщиной). Как до, так и после фиксации следует избегать контактов кусочков с водой, так как она растворяет гликоген. Материал можно залить в парафин и перед окрашиванием целлоидинировать. Для этого наклеенные на предметное стекло парафнновые срезы обрабатывают ксилолом и 34 96'/ спиртом, затем переносят на 1 — 2 мин в спирт-эфир и далее на 1 — 2 мин в 2/ раствор целлоидина. Вынимают стекла из целлоидина и дают ему стечь. Ждут, пока не образуется тонкая пленка (15 — 30 с)„ и переносят препараты на несколько минут в 70 — 80% спирт для уплотнения целлоидина.
Целлоидинирование защищает гликоген от растворения. Методика окрашивания целлоидиниров а н н ы х с р е з о в: 1) срезы ополаскивают в дистиллированной воде; 2) помещают в 0,23% распюр перйодата калия или в 0,27'/о раствор перйодата натрия на 15 — 25 мин (в темноте). Раствор перйодата готовят перед употреблением, используют 1 раз; 3) промывают в 2 порциях дистиллированной воды по 3 — 4 мин в каждой; 4) обрабатывают в сернистой воде 2 мин; 5) переносят в реактив Шиффа на 20 — 25 мин (в темноте); 6) обрабатывают в 3 порциях сернистой воды по 3 — 4 мин в каждой; 7) промывают в повторно сменяемой дистиллированной воде (10 — 15 мин); 8) докрашивают (по желанию) гематоксилином; 9) промывают водопроводной водой, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
Р е з у л ь т а т: гликоген и другие углеводные компоненты окрашиваются в красный цвет. Исчезновение окраски после переваривания гликогена а-амилазой (0,5'/о раствор в дистиллированной воде), забуференной 4 мл ацетата до рН 5,5 — 6,0 30 мин — 1 ч при ЗT С, свидетельствует о том, что окрашенный продукт был гликогеном.
Окрашиваиие липидов суданом 1П. Используют замороженные срезы материала, фиксированного в формалине (см. главу 21) или нефиксированного. Заливка в парафин или целлоидин невозможна, так как при использовании этих методов уплотнения жиры экстрагируются. П р и г о т о в л е н и е р а с т в о р а. В 100 мл горячего 70/о спирта растворяют 2 — 3 г судана 1П, охлаждают и фильтруют. Методика окраши ванна: 1) срезы из дистиллированной воды переносят в 50'/~ спирт; 2) помещают в раствор судана 111 на 20 — 30 мин в закрытом сосуде; 3) ополаскивают в 50'4 спирте; 4) ополаскивают в дистиллированной воде; 5) окрашивают ядра гематоксилином (без последующей дифференцировки); 6) промывают в водопроводной воде 10 — 20 мин; 7) заключают в глицеринжелатину (см.
главу 21). Р е з у л ь т а т: жир окрашивается в оранжевый цвет, ядра синие. Метод выявления дегидрогеназы янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеиазы). Из свежевзятого материала приготовляют криостатные срезы нефиксированной ткани. Срезы либо прямо переносят в инкубационную среду, либо наклеивают на предметное стекло и реакцию проводят на стекле. Приготовление инкубационной среды: соединяют 0,1 мл 0,1 М раствора ХаН РО4, 0„4 мл 0,1 М раствора )ча НРО4, 2,5 мл 1,69'/о зз ХаС1, 0,1 мл 1,15% раствора КС1, 0,05 мл 1,22% раствора СаС~, 1 мл 1% раствора неотетразолия и 1,4 мл 0,1 М (1,б4%) раствора сукцината натрия (янтарнокислого натрия). К раствору сукцината натрия предварительно прибавляют ХаОН, доводя рН до 7,5 — 7,3.
Методика проведения реакции: 1)замороженные срезы переносят в инкубационную среду и выдерживают в термостате при 37 ' С 20 — 120 мин; 2) ополаскивают дистиллированной водой; 3) фиксируют в 4'/~ нейтральном формалине в течение 30 мин; 4) ополаскивают дистиллированной водой; 5) заключают в глицерин-желатину, Р е з ул ь тат реакции: при высокой активности сукцинатдегидрогеназы продукт реакции окрашен в сине-фиолетовый цвет, при меньшей активности — в красновато-фиолетовый. Выявление АТФазы ио методу Вахштейна — Мейзеля. Применяют замороженные срезы нефиксированной или фиксированной в холодном ацетоне ткани. Инкубационная среда.
Растворить 25 мг двунатриевой соли АТФ в 20 мл дистиллированной воды, добавить 20 мл 0,2 М трис-буфера (РН 7,2), 1 — 3 мл 2% раствора нитрата свинца 1РЬ(ХО ) ], 5 мл 0,1 М раствора сульфата магния (МйбО ) и долить 2 мл дистиллированной воды. Если нужно, отфильтровать, довести рН до 7,2 (инкубационную среду готовить перед употреблением и добавлять ингредиенты в указанном порядке). Методика проведения реакции: 1) помещают приготовленные срезы в инкубационную среду на 10 — 60 мин при ЗT С; 2) тщательно промывают в нескольких порциях дистиллированной воды; 3) обрабатывают раствором желтого сульфида аммония в разведении 1:50 в течение 2 мин (появляется темно-коричневая окраска среза); 4) быстро ополаскивают в дистиллированной воде; 5) заключают в глицерин-желатину или после обезвоживания в бальзам. Р е з у л ь т а т: места АТФазной активности окрашены в коричнево-черный цвет.
!1. ОБЩАЯ ГИСТОЛОГИЯ Глава 4 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТКАНЕЙ Ткани появляются в многоклеточных организмах и представляют собой следующий за клеткой более высокий уровень организации живой материи. Основными элементами тканей являются клетки и их производные — неклеточные структуры. Образование тканей — г и с т о г е н е з — происходит у человека и животных в эмбриональном периоде из зародышевых листков — эктодермы, энтодермы, мезодермы, а также мезенхимы. Гистогенез — сложный процессе, включающий размножение клеток, их рост, дифференцировку, разрушение, миграцию и межклеточное взаимодействие (интеграция).
Ведущими компонентами гистогенеза, определяющими специализацию тканей, являются дифференцировка и взаимодействие. Диффереицировка — основной закон индивидуального развития, согласно которому из гомогешюго и общего возникает гетерогенное и частное. Дифференцнровка определяет разделение функций между частями организма. В основе дифференцировки лежит дифференциальная активность генов, при этом происходит блокирование отдельных компонентов генома клетки и ограничение потенций. Если исходная клетка — зигота и формируемые из нее бластомеры тотипотентны, т. е. из них может развиться целый организм, то клетки последующих стадий развития теряют эту способность, дифференцируются. В составе зародышевых листков— эктодермы, энтодермы, мезодермы образуются стволовые клетки (СК), которые могут дифференцироваться в различных направлениях и, таким образом, являются полипотентныии.
Оии могут давать начало более дифференцированным, так называемым полустволовым клеткам с более ограниченными возможностями развития и далее — уншютентным клеткам, развивающимся в одном направлении, специализирующимся в определенный тип клеток (мышечные, нервные и др.). Таким образом, процесс дифференцировки тканевых клеток, начиная от стволовых, проходит ряд последовательных стадий. Дифферон — последовательный ряд клеток, развивающихся из общего предшественника.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
