О.Ф. Петрухина - Аналитическая химия (Физические и физико=химические методы анализа) (1110109), страница 97
Текст из файла (страница 97)
Бюкс дважды ополаскивают дистиллированной водой порциями около 0,5 мл (5 — 1О капель) и осторожно пере- 440 носят в колонку после впитывания анализируемого раствора в слой декстрана. Такая осторожность необходима для формирования четкой, неразмытой зоны. После этого объем вносимой воды в верхнюю часть колонки не имеет значения, и воду добавляют по мере ее протекания через колонку. В пробирки вместимостью 5 мл начинают собирать первые окрашенные в голубой цвет капли голубого декстрана. Записывают объем элюата (объем воды в цилиндре). Всего отбирают пробы объемом по 5 мл в 22 пробирки. Определение голубого декстрана и арсеназо 1.
Содержимое пробирки (5 мл) переносят в кювету с толщиной поглощающего слоя ! = 1О мм и измеряют оптическую плотность А на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром (к = б30 нм) для голубого декстрана и с зеленым светофильтром (к = 540 нм) для арсеназо 1. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду. По градуировочным графикам находят содержание обоих компонентов в каждой пробирке (кп мг).
Содержание голубого декстрана и арсеназо 1 по отдельности в исходной смеси определяют суммированием количеств этих веществ в пробирках б = 8! + Вз + Л1 + .- Определение нитрофенола. К содержимому пробирки (5 мл) добавляют 1 мл 20%-ного раствора ХаОН, закрывают пробирку пробкой и тщательно перемешивают. Затем щелочной раствор нитрофенола переносят в кювету с толщиной слоя 3 мм и измеряют его оптическую плотность А на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром (к = 380 нм). В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду. По градуировочному графику находят содержание нитрофенола (в мг) в каждой пробирке, затем суммированием определяют общее содержание нитрофенола в анализируемом растворе.
По данным гель-хроматографии строят график зависимости 8 = Г( К) и рассчитывают коэффициент распределения К, по уравнению (5.55), число теоретических тарелок М и критерий разделения для арсеназо 1 и нитрофенола по формулам (5.18) и (5.22). Вариант 2 В этом варианте работы предварительно проводится подбор сорбента — фракции сефадекса, обеспечивающего более полное разделение анализируемой смеси. Выполнение работы Подбор условий для количественного разделения голубого декстрана, арсеназо 1 и нитрофенола. Подбирают определенную фракцию сефадекса, пользуясь табл. 5.2, исходя нз молекулярных масс разделяемых веществ и сефадексов. Очевидно, что наиболее пригодные сефадексы О-15, О-25 и (3-50.
441 Приборы и реактивы Хроматографическая колонка с сефадексом О-!5, длиной 44 см, диаметром 1,5 см. Электроплитка. Фотоэлектроколориметр. Градуированные пробирки вместимостью 5 мл. Мерный цилиндр вместимостью 25 мл. Конические колбы вместимостью 100 мл. Микробюретка вместимостью 5 мл. Раствор ХаС1, 0,05%-ный. Раствор К,Мп04, 0,05 М. Раствор НзБОт 1 М. Анализируемый раствор; смесь щавелевой кислоты (8 мг/мл) и голубого декстрана (2 мг/мл). Выполнение работы Жидкость в колонке опускают до уровня сефадекса. Не донускаите нроскока жидкости ниже уровня сефадекса/Анализируемый раствор в один прием осторожно, по стеклянной палочке переливают из бюкса в верхнюю часть колонки, стараясь не взмутить верхний слой сефадекса.
Одновременно под кран колонки подставляют мерный цилиндр и открывают кран. После впитывания раствора в верхний слой сефадекса вводят дважды по 0,5 мл (5— 10 капель) промывной жидкости (0,05%-ный раствор ХаС1), используя ее для ополаскивания бюкса. Такая осторожность необходима для формирования четкой, неразмытой зоны. Когда голубая зона продвинется по колонке на 1 — 2 см, верхнюю часть колонки полностью заполняют 0,05%-ным раствором хлорида натрия. В про,бирки вместимостью 5 мл начинают собирать первые окрашенные в голубой цвет капли элюата. Записывают объем элюата.
После выхода голубого декстрана (практически это первые 5 мл элюата) продолжают собирать элюат фракциями по 2 мл. Собирают 12 фракций (по 2 мл), в которых определяют содержание щавелевой кислоты. Содержание голубого декстрана в элюате определяют фотометрически по методике, приведенной в работе 1. Для определения щавелевой кислоты элюат объемом 2 мл из градуированной пробирки переносят в коническую колбу, пробирку ополаскивают 2 — 3 раза дистиллированной водой и присоединяют промывные воды к элюату.
Добавляют 2 мл раствора Нз804, нагревают на плитке до появления слабых паров и медленно, по каплям, титруют 0,05 М раствором КМп04 из микробюретки до появления бледно-розовой окраски. В тех же условиях проводят холостой опыт, титруя 2 мл элюата, взятого из цилиндра ( 1'км""„о ) 4 Далее проводят хроматографирование анализируемой смеси (ее образцы выдаются в бюксах) на трех отобранных сефадексах В каждую колонку, заполненную соответственно сефадексом С-15, С-25, С-50, вносят смесь веществ из каждого бюкса. Фиксируют время начала эксперимента и проводят хроматографирование, как описано в варианте 1 работы. Первые окрашенные в голубой цвет капли голубого декстрана начинают собирать в мерные пробирки емкостью 5 мл.
Затем собирают окрашенный в красный цвет элюат с арсеназо 1. После этого собирают бесцветный элюат, содержащий нитрофенол, причем в каждую пробирку сразу после ее заполнения добавляют по 1 мл 20%-ного раствора )ЧаОН. В присутствии нитрофенола раствор окрашивается в желтый цвет.
Прекращают собирать элюат, когда в очередной пробирке прекратится образование желтого раствора. Отмечают время окончания эксперимента. Результаты записывают в таблицу: О-15 С-25 Сю-50 Фракция сефадекса Время эксперимента Число пробирок с голубым декстраиом Число пробирок с арсеиазо ! Число пробирок с иитрофеиолом Четкость разделения зои (+, -) Анализируют полученные результаты. Делают вывод о пригодности использования фракций сефадекса для количественного разделения анализируемой смеси. Разделение голубого декстрана, арсеназо 1 и нитрофенола с использованием выбранной фракции сефадекса и их количественное определение проводят согласно варианту 1.
Работа 2. Определение голубого декстрана и щавелевой кислоты в их смеси Разделение голубого декстрана и щавелевой кислоты на колонке с сефадексом С-15 основано на различии их молекулярных масс. Голубой декстран — окрашенное в голубой цвет вещество типа полисахаридов с молекулярной массой более 2 млн. щавелевая кислота НзСз04 2НзО имеет молекулярную массу 126.
Вначале во внешнем объеме из колонки вымывается голубой декстран, затем — щавелевая кислота. Содержание голубого декстрана в элюате определяют фотометрически с красным светофильтром (л = 630 нм). Шавелевую кислоту определяют титрованием перманганатом калия в сернокислой среде при нагревании (70 — 80 'С): 2КМп04+ 5НзСз04+ ЗНзВО4 = 2МпЮ4+ 1ОСОз + Кз8О4+ 8НзО 442 Результаты титрования записываются в таблицу: ьа фракиии Обьем КмаОо мд СодеРжание Нгаоо мг Содержание щавелевой кислоты в каждой фракции (в мг) рассчитывают по формуле: = С</а..
„.О.) !);М.Π— Р."М'.О.) бб!/а,...С.О.,..О) По данным гель-хроматографии строят график зависимости е = /!)г), рассчитывают )г„, зная массу сухого сефадекса в колонке, и, воспользовавшись данными табл. 5.2, рассчитывают число теоретических тарелок У„ВЭТТ и К,„для щавелевой кислоты по уравнениям (5.18, 5.22, 5.56). Работа 3, Определение гемоглобина и глицина в их смеси Разделение гемоглобина и глицина на колонке с сефадексом О-25 происходит вследствие различия их молекулярных масс. Гемоглобин — белок, окрашенный в красно-коричневый цвет, молекулярная масса около 63500. Глицин — аминокислота )к!Н2СНзСООН с молекулярной массой 75. Вначале во внешнем объеме из колонки вымывается гемоглобин, а затем глицин. Гемоглобин в элюате количественно определяют фотометрически по собственной его окраске (к = 450 нм). Содержание глицина определяют также фотометрически после перевода его в окрашенный продукт.
Для этого используют цветную реакцию глицина с нингидрином в присутствии хлорида кадмия. Приборы и реактивы Хроматографическая колонка с сефадексом О-25. Фотоэлектро кол ори метр. Водяная баня. Градуированные пробирки вместимостью 5 мл. Мерные цилиндры вместимостью 25 и !О мл. Конические колбы вместимостью 50 мл. Пипетки вместимостью 1 и 5 мл.
Раствор 1к1аС!, 0,05%-ный. Гемоглобин, раствор в 0,5%-ном растворе хлорида натрия, с концентрацией 3 мг/мл. Глицин, свежеприготовленный раствор с концентрацией 1 мг/мл. Хлорид кадмия, насыщенный водный раствор. 444 Нингидрин, 2%-ный ацетоновый раствор. Бутанол. Выполнение работы Жидкость в колонке опускают до уровня сефадекса. Не дааускаате араскака жидкости ниже уравал сефадекса! Анализируемый раствор (около 2 мл) в один прием осторожно, по стенке, переливают из бюкса в верхнюю часть колонки, стараясь не взмутить верхний слой сефадекса.
Одновременно под кран колонки подставляют мерный цилиндр и открывают кран. Бюкс ополаскивают 0,05%-ным раствором 1КаС1 порциями около 0,5 мл (5 — 1О капель), промывные воды после впитывания раствора в слой сефадекса осторожно переносят в колонку. Операцию с промывными водами повторяют дважды после впитывания предыдущих порций. После этого промывной жидкостью наполняют целиком верхнюю часть колонки. В пробирки вместимостью 5 мл начинают собирать первые окрашенные капли элюата. Записывают объем элюата. После выхода гемоглобина (первые три фракции по 5 мл) продолжают собирать элюат в пробирки, Глицин вымывается из колонки в 4 — 8 фракциях, в которых затем определяют его количественно. Для количественного определения гемоглобина содержимое пробирки (5 мл) переносят в кювету с толщиной поглощающего слоя! = 10 мм и измеряют оптическую плотность А на фотоэлектроколориметре с фиолетовым светофильтром (к = 450 нм).
В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду. По градуировочному графику находят содержание гемоглобина (в мг) в каждой пробирке (я,) и суммированием определяют содержание гемоглобина в исходном растворе я = л! + л2 + рз. В коническую колбу вместимостью 50 мл вносят 1 мл пробы из четвертой пробирки, во вторую коническую колбу — из пятой пробирки и т. д. В каждую коническую колбу добавляют 5 мл бутанола, 2 капли насьпценного раствора СдС!з и 1 мл ацетонового раствора нингидрина.
Все растворы нагревают 1О мин на кипящей водяной бане, охлаждают, переносят в мерные цилиндры вместимостью 1О мл и доводят обьем бутанолом до 6 мл. Пипеткой отбирают 3 мл окрашенного слоя, переносят в кювету с толшиной слоя ! = 10 мм, добавляют 0,5 мл бутанола для разрушения водной эмульсии и фотометрируют зеленым светофильтром (). = 515 нм). В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий все компоненты, кроме глицина.
По градуировочному графику находят содержание глицина (ян мг), содержание глицина в одной фракции равно 5е, Содержание глицина в анализируемом растворе определяют суммированием (а4 а5 "' ая)' По данным гель-хроматографии строят график зависимости л = ~( У), рассчитывают Уо, коэффициент распределения К, константу доступности К,„и число теоретических тарелок %для глицина. Работа 4. Выбор условий разделения голубого декстрана, арсеназо 1 и и-нитрозодиметиланилина на сефадексе и их количественное определение Разделение голубого декстрана (М= 2,5 млн.), арсеназо 1 (М = 592) и и-нитрозодиметиланилина (М= 150) на колонке с сефадексом О-25 происходит за счет различия их молекулярных масс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
