О.Ф. Петрухина - Аналитическая химия (Физические и физико=химические методы анализа) (1110109), страница 96
Текст из файла (страница 96)
В этом уравнении второй член описывает проникновение вещества в поры, третий член Кз Х вЂ” адсорбцию веществ на скелете сорбента (для слабонабухающих), четвертый член Кз Р"„— распределение вещества между подвижной фазой и фазой геля в целом, что наблюдается только для малопересеченных сильнонабухающих гелей, для которых )~в >) 'г'„и Для таких гелей принимают, что не существуют раздельйо поры и матрица, а есть одна система, в которой и происходит распределение макромолекул.
Явления адсорбции и распределения в гелях разделить очень трудно, и обычно оба явления рассматривают вместе. Например, низкомолекулярные ароматические и гетероциклические соединения (фенол и пиридин) сильнее задерживаются в гранулах сефадекса, чем это можно ожидать только вследствие диффузии, т. е. га > )'а те,~, что, вероятно, можно обьяснить в некоторых случаях образованием водородных связей между ОН-группами сефадекса и молекулами разделяемых соединений.
В отсутствие взаимодействия веществ с фазой геля Кт = 0 и Кз = 0 и общее уравнение приобретает первоначальный вид. Элюенты. В гель-хроматографии элюенты (подвижная фаза) выбирают, главным образом, исходя из требований, чтобы они растворяли разделяемые вещества и обладали малой вязкостью. Для гидрофильных веществ при работе с мягкими гелями используются водные растворы с определенной ионной силой и рН. Для разделения полимеров, не растворимых в воде, применяют органические растворители такие, как тетрагидрофуран, диметилформамид, толуол и др.
Кроме того, при выборе элюента следует учитывать, что подвижная фаза должна быль совместима с используемым сорбентом. Иногда замена одного растворителя другим приводит к достижению разделения вследствие взаимодействия растворителя и разделяемых веществ. Приведем такой пример. При производстве эпоксидной смолы ЭД-20 СН1 — СН вЂ” СНг — О (СН1)з / ~ / О-СНг — СН вЂ” СНг х, I О О 436 Рис. 5.25. Выходная кривая разделения на сефадексе голубого декстрана (А), ар- сеназо ( (В), нитрофенола (С) в качестве примеси образуется аналогичное соединение, но на одном конце которого вместо эпокси-группы находится гидроксильная группа — о-сн, — сн-снз ( он ' Оба соединения имеют одинаковую молекулярную массу (-400) и должны при хроматографировании иметь одинаковые ка.
Но при хроматографировании на гидрофобном геле стирогеле с подвижной фазой тетрагидрофураном оба соединения разделяются, т. е. выходят с разными кю Первым элюируется примесное соединение, которое за счет ОН-группы сольватируется растворителем, в результате чего молекула приобретает больший размер. В разделении методом гель-хроматографии учавствует лишь незначительная часть объема колонки ('и; — )~) (рис. 5.25), поэтому число компонентов, которое можно разделить, ограничено. И, как следствие, в гель-хроматографии применяют довольно длинные колонки, но в этом случае происходит размывание зон и увеличивается ВЭТТ.
Особенно значительно размывание зоны в колонке при разделении высокомолекулярных вешеств, так как на ВЭТТ влияет скорость диффузии вещества внутрь пор: чем больше молекулярная масса диффундируюшего вещества, тем больше сопротивление массопередаче (меньше скорость диффу- 437 зии); при определенной молекулярной массе оно достигает максимума, а затем начинает уменьшаться и становится равным нулю, когда размеры молекул становятся больше размеров пор, Вследствие этих причин максимальное число разделяемых компонентов в гель-хроматографии в три раза меньше, чем на аналогичной колонке в газовой или жидкостной хроматографии при равном числе теоретических тарелок.
Для определения эффективности работы колонки рассчитывают число теоретических тарелок Ж (уравнение 5.18) и ВЭТТ (уравнение 5.22) по пику низкомолекулярного вещества, свободно проникающего во все поры сорбента. Степень разделения Я находят по уравнению (5.29). Аппаратура. Гель-хроматографию проводят в хроматографических колонках или на пластинках в тонком слое, так что аппаратура в гель-хроматографии практически не отличается от аппаратуры, используемой в других вариантах жидкостной хроматографии.
Это может быть обычный колоночный вариант со сбором фракций ручным способом или с помощью коллектора, или любой жидкостной хроматограф, описанный в разд. 5.3, с соответствующими колонками, Из детекторов наибольшее применение в высокоэффективной гель-хроматографии нашли проточный оптический детектор, дифференциальный рефрактометр для анализа полимеров, вискозиметрический детектор. Тонкослойная гель-хроматография осуществляется на стеклянных пластинках, на которых тонким слоем нанесен гель образец на стартовую линию наносится в виде точки, и подвижная фаза движется вдоль слоя только нисходящим методом (см.
разд. 5.35). За ходом хроматографирования наблюдают по движению окрашенного стандарта, который одновременно наносят на стартовую линию. Возможности метода. Гель-хроматография широко применяется в биохимии, синтетической органической химии и химии полимеров. Основные направления применения гель-хроматографии следующие. 1. Групповое отделение высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных. В биохимии это разделение называется обессоливанием. Этот метод позволяет получить чистые белки, нуклеиновые кислоты с большой молекулярной массой, при этом низкомолекулярные соли, например ХаС!, задерживаются в порах сорбента.
2. Разделение (фракционирование) компонентов смеси, различающихся по молекулярным массам, но не столь значительно, как для указанных в пункте 1. Например, на сефадексе 0-150 достигается разделение ферментов селезенки с молекулярными массами 100000, 45000 и 24000. В связи с разработкой сорбентов особо высокой дисперсности гель-хроматографию все чаще при- 438 меняют для разделения низкомолекулярных соединений, например, триглицеридов высших жирных кислот (М= 200— 500) в процессе физико-химических превращений олигомеров в полимеры (М = 500— 1000).
3. Определение молекулярных масс белков, олигомеров, полимеров, углеводородов, основанное на линейной зависимости объемов выхода веществ от молекулярной массы; маги, Рис. 52б. Градуированный график лля определения молекулярных масс в гель- хроматограФии Вопросы и задачи 1. На чем основано разделение веществ в гель-проникающей хроматографии? 2. Что является подвижной и неподвижной фазами в гель-хроматографии? 3. Что представляет собой сорбент в гель-хроматографии, какую роль он играет? 4. Из чего складывается общий объем хроматографического слоя геля, используемого в качестве неподвижной фазы в гель- хроматографии? 5.
Запишите выражение для коэффициента распределения в гель-хроматографии. 439 р'~/р~ = /г18М (5.58) Каждый сорбент характеризуется своей градуировочной кривой, по которой находят молекулярные массы веществ (рис. 5.2б). В качестве калибровочных соединений (стандартов) используют вещества, близкие по своей природе к исследуемым веществам. Так как на данной колонке объем выхода вещества воспроизводится очень точно, то вначале через колонки пропускают стандартные вещества и определяют их объемы выхода, строят градуировочный график, а затем, зная )'к вещества с неизвестной молекулярной массой, находят ее по графику. 4.
Тонкослойная гель-хроматография находит широкое применение для определения молекулярно-массового и композиционного распределения полимеров, в клинической диагностике как экспресс-метод для определения патологических белков в сыворотке крови, спинномозговой жидкости, для проверки чистоты препаратов и т. д. 6. Приведите общее уравнение гель-проникающей хроматографии и поясните его смысл. 7. Укажите интервал значений коэффициента распределения в гель-хроматографии. 8. Назовите области применения гель-хроматографии. 9. Как определяют молекулярно-массовое распределение полимеров7 П рактические работы Работа 1. Определение арсеназо 1, голубого декстрана и нитрофенола в их смеси Разделение красителя арсеназо ! (молекулярная масса 592,3) и нитрофенола (молекулярная масса 139,!) на колонке с сефадексом О-25 происходит вследствие различия их молекулярных масс.
Первым вымывается арсеназо 1, как имеющий большую молекулярную массу, а затем нитрофенол. Для определения внешнего объема колонки (величина !') в анализируемую смесь добавляют высокомолекулярный полисахарид — голубой декстран (молекулярная масса до 2 млн.) Это вещество вымывается из колонки во внешнем объеме. Количественное определение голубого декстрана, арсеназо ! и нитрофенола проводят фотометрически по их собственной окраске. Вариант 1 Приборы и реактивы Хроматографическая колонка с сефадексом О-25 длиной 45 см, диаметром 2,5 см.
Фотоэлектроколориметр. Градуированные пробирки вместимостью 5 мл. Стаканы вместимостью 100 мл. Пипетки вместимостью 1 мл. Раствор )ЧаОН, 20%-ный. Анализируемый раствор; смесь растворов голубого декстрана, арсеназо 1 и нитрофенола, содержащие по ! мг/мл, подкисленная двумя каплями 2 М СНзСООН.
Выполнение работы Хроматографирование анализируемой смеси. Воду в колонке опускают до уровня сефадекса. Не допускайте проскока жидкости ниже уровня сефадекса! Анализируемый раствор (около 2 мл) в один прием осторожно по стеклянной палочке вливают из бюкса в колонку, стараясь не взмутить верхний слой сефадекса. Одновременно под кран колонки подставляют мерный цилиндр и открывают кран.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
