О.Ф. Петрухина - Аналитическая химия (Физические и физико=химические методы анализа) (1110109), страница 105
Текст из файла (страница 105)
Методические основы ТСХ. Методика разделения и определения веществ в ТСХ включает следующие основные стадии: 1) приготовление слоя сорбента; 2) нанесение пробы анализируемой смеси на слой сорбента; 3) разделение компонентов анализируемой смеси на отдельные зоны в потоке подвижной фазы; 4) обнаружение зон на слое сорбента; 5) количественная оценка — измерение соответствующих величин удерживания и определение содержания веществ в зонах.
Как уже было отмечено выше, по технике эксперимента и используемому оборудованию между двумя методами плоскостной хроматографии — ТСХ и на бумаге — существует много общего. Поэтому в данном разделе будет обращено внимание на те методические особенности, которые отличают ТСХ от хроматографии на бумаге.
В ТСХ сорбенты наносят на пластинки, при этом используют пластинки двух основных типов: с незакрепленным и закрепленным слоем сорбента, которые готовят из сухого сорбента или суспензии сорбента в подходящем растворителе (чаще с добавлением связующего вещества). Пластинки с незакрепленным слоем готовить легче и быстрее, однако их достоинства на этом исчерпываются. В аналитической практике незакрепленные слои практически потеряли свое значение. Основное преимущество пла- 477 Рис. дуб. Каме ы р лля получения хроматограмм с зак е ленным (б) слоями с закрепленным (а) и незакреп- стинок с закрепленным слоем состоит в л ше" способности. Кроме того о ит в лучшей разделительной ращении, зоны на закреп е того, они механически п очны, р ы, просты в об- ются фирменные хром ф репленном слое легче п о роявлять.
Выпуска- слоем, приготовля роматографические п ас л тинки с закрепленным емые в заводских слов у иях Они стали основ а ическим материалом для Т б й о аторно техники. Применение готовых пласт- и- стадию приготовления ело . ния слоя. Операция нанесения пробы анализи емы б т ляется в прин ипе т ии. ычно для этой цели применяют калиброван- боратории оснащен или микрошппицы. Мн р .
огне современные ла- томатическими устро ны специальными пол а у втоматическими и ав- ность дозируемого объ . В строиствами, обеспечиваю шими высокую точ- разбавленных яство ов ема. ряде сл аев, а в виде тонкой полос ( б воров, пробу наносят не точеч чечно на пластинку, выше). ы оъемп обып р ри этом в несколько раз Процесс хроматографирования и ов герметичном сос д ия проводят в камере — любом ляется типом хроматографически ис фазы особенно пр олжна ыть пасы и использовании смесей ности растворителей ( й различных по поляр- случае, когда количе (истинные значения я Я получаются в том ество подвижной казы не испарения и не увеличивается вел е уменьшается за счет вой фазы).
личивается вследствие конденсации из газоак и в методе бумажной хромато а и, ще всего элюируют графин, хроматограммы чат по линейному восходя е существуют и специал шему варианту. Однако повторное элюирован ( ьные варианты элюи ирования, например, 4 ние (в том же нап ав ?8 н ( р ленин), многомерная хроматография (повторное элюирование в перпендикулярном направлении), непрерывное хроматографирование (с непрерывной подачей подвижной фазы вплоть до полного разделения), градиентное элюирование (с изменением состава подвижной фазы в процессе элюирования) и некоторые другие. Все перечисленные методические приемы направлены на достижение более качественного разделения. Проявление хроматограмм, необходимое в случае неокрашенных или слабоокрашенных зон, осуществляют таким же образом, как и в бумажной хроматографии. Однако в отличие от бумажных хроматограмм тонкослойные хроматограммы можно опрыскивать более активными проявляющими реагентами, например неорганическими кислотами, На заключительной стадии хроматографического метода проводится анализ хроматограмм, состоящий в идентификации и количественном определении разделенных компонентов.
Аналитическое применение ТСХ. Данный метод имеет три основных области применения: качественный анализ веществ и их смесей, количественный анализ многокомпонентных смесей и препаративное выделение индивидуальных компонентов из смесей. К собственно аналитическому применению метода относятся качественное и количественное определение соединений (препаративная ТСХ является одним из основных инструментов синтетической органической химии). Качественный анализ до сих пор является наиболее распространенным практическим приложением ТСХ.
Идентифицировать разделенные компоненты можно непосредственно на хроматограмме или после выделения их из слоя сорбента(второй способ — это самостоятельный раздел курса "Качественный анализ" 'в аналитической химии и поэтому здесь не будет рассматриваться). Как и в бумажной хроматографии, основной качественной характеристикой вещества в ТСХ служит величина Яу. По положению хроматографической зоны на хроматограмме можно судить о присутствии того или иного компонента в анализируемой смеси, при этом используют табличное значение ЯГ определяемого соединения (в данной хроматографической системе) или сравнивают найденную величину Яг с величиной А~соответствующим образом подобранного вещества-"свидетеля' (стандарта).
Следует иметь в виду, что для получения величины Яг как индивидуальной характеристики данного вещества большое, если не главное значение имеет воспроизводимость условий разделения. Поэтому такие параметры, как качество и чистота сорбента и растворителей, температура, влажность, степень насыщения камеры парами подвижной фазы, толщина слоя и другие, влияющие на воспроизводимость значений Я-, по возможности необходимо полдер- 479 живать постоянными. Только при этом условии величина ЛГ является физико-химической константой вешества в данной хроматографической системе. Для точной идентификации неизвестных соединений на хроматограммах необходимо использовать подвижные фазы разной полярности.
При совпадении значений Л определяемых соединений со значениями Ау вешеств-"свидетелей", нанесенных на одну пластинку с исследуемой смесью, можно делать вывод о качественном составе смеси. В случае анализа вегдеств с одинаковой подвижностью или близкими значениями Я. их можно перевести в производные с помощью подходящей химической реакции (до нанесения пробы или непосредственно на пластинке). Этот же прием полезен, когда требуется выяснить природу анализируемых вешеств, или же при разделении вешеств, прямой хроматографический анализ которых невозможен, например, из-за высокой летучести.
Важную информацию о природе веществ дает характерная окраска в хроматографических зонах или окрашенных зон, образуюшихся после проявления хроматограммы под действием специфических проявляющих реагентов (т. е. после проведения соответствующей качественной реакции в слое сорбента). Более достоверные сведения о качественном составе анализируемой смеси можно получить с помощью инструментальных аналитических методов, регистрируя специфические аналитические свойства компонентов в зонах, например, способность поглошать УФ-излучение или флуоресцировать под действием УФ-излучения, или методом радиохроматографии в тонком слое с использованием радиоактивных изотопов (индикаторов). Количественный анализ смесей веществ методом ТСХ во многих случаях дает результаты, сравнимые с результатами других аналитических методов.
Существует два основных способа определения вешеств в ТСХ вЂ” непосредственно на хроматограмме и после выделения из слоя сорбента. Количественное определение непосредственно на хроматограмме основано на том, что площадь и интенсивность окраски хроматографических зон, а также других инструментально измеряемых аналитических свойств присутствующих веществ (способность поглощать и отражать излучение, интенсивность флуоресценции, радиоактивность и т, д.) зависят от содержания вещества в зоне.
Единой теоретической зависимости между площадью зоны и количеством в ней вещества не существует, так как на характер этой зависимости влияет природа вешества, толщина слоя, метод определения, абсолютное количество вещества в зоне и другие параметры. Тем не менее, если поддерживать эти условия постоянными и хроматографировать пробы анализируемого вешества и пробу образца сравнения для построения градуировочного графика на одной пластинке, то метод позволяет прово- 480 дить количественное определение с достаточной точностью.
Чаще всего в ТСХ измеряют зависимость площади, корня из плошади или логарифма площади от логарифма количества вещества (см. разд. 5.3.4). Из инструментальных методов определения вегцеств в хроматографических зонах наиболее применима фотоденситометрия, основанная на количественном сканировании окрашенных зон лучом монохроматического света (вдоль или поперек пластинки) и измерении доли поглогценного или отраженного веществом света. Электрический сигнал, пропорциональный разности интенсивности падающего и прошедшего (отраженного) света, регистрируется в виде кривых, аналогичных по форме пикам на хроматограммах в ВЭЖХ (рис. 5.37).
Количество вещества находят по градуировочному графику, построенному в координатах "плошадь или высота пика — масса вещества в зоне". При атом учитывается результат холостого опыта, т. е. поправка на "пустой" слой, не содержащий определяемых веществ. Для определения неокрашенных веществ применяют метод спектрофотометрии с измерением оптической плотности в режиме пропускания или отражения.
Для этой цели используют специальные сканирующие спектрофотометры или обычные спектрофотометры со специальной приставкой. Довольно распространен также флуориметрический метод, заключающийся в УФ-облучении хроматографического слоя и измерении вторичного излучения (флуоресценции) отдельных веществ или же в измерении ослабления гашения флуоресценции добавляемого в слой флуоресцентного индикатора. Существуют приборы, предназначенные специально для измерения поглощения и флуоресценции пятен. Количественную оценку тоикослойных хроматограмм радиоактивных веществ проводят радиометрическим методом. Полуколичественное определение содержания веществ в зонах обычно осуществляют сравнением размеров или интенсивности Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
