Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации (1105654), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Закрытые пробирки тщательноперемешивались и помещались на 2 ч в нагревательный блок при 160 0С. После охлаждениядо комнатной температуры оптическая плотность определялась при длине волны 600 нмпротив раствора сравнения, приготовленного таким же образом, но без добавления пробы.ХПК определялось с помощью калибровочного графика в диапазоне концентраций от 0,1 до1,2 г ХПК/л с использованием растворов глюкозы и СH3COONa×3H2O известнойконцентрации.2.2.12 Определение концентрации ВСОпределение концентрации ВС проводилось с использованием метода ШомодиНельсона [179].2.2.13 Определение концентрации глюкозыДля определения концентрации глюкозы в среде использовался глюкозидазный метод сприменением стандартного реагента фирмы Импакт (Россия).Согласно инструкции производителя в результате окисления β-D-глюкозы под действиемглюкооксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода.
Под действиемпероксидазы H2O2 окисляет 4-аминоантипирин в присутствии фенола в окрашенноесоединение (хинонимин), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрацииглюкозы в анализируемом образце и измеряется спектрофотометрически при длине волны500 нм.2.2.14 Определение концентрации органических кислот- молочной кислотыКонцентрация L(+)-изомера МК определялась ферментативным лактатоксидазнопероксидазным методом с применением реагента фирмы Sentinel (Италия).
В ходеферментативной реакции L-МК окисляется лактатоксидазой до пирувата, при этомобразуется H2O2. В присутствии H2O2 под действием пероксидазы 4-аминоантипирин57окисляется и конденсируется с бесцветным донором водорода - N-этил-N-(2-гидрокси-3сульфопропил)-3-метиланилином с образованием окрашенного соединения - хинонимина.Количество хинонимина, которое образуется в ходе ферментативной реакции,эквивалентно исходному количеству L-МК.Рабочие растворы готовились согласно методикам фирмы–производителя Sentinel(Италия).
При проведении расчетов учитывалась концентрация стандартного раствора L-МК,который содержится в наборе реактивов. Расчет концентрации L-МК в образцах проводилсяс использованием уравнения:МК=(А/Аs)×МКs,где МК и МКs – концентрация МК в образце и стандарте, соответственно, г/л;А и Аs – оптическая плотность раствора образца и стандарта, соответственно, придлине волны 550 нм.-фумаровой кислотыКонцентрация фумаровой кислоты определялась ферментативным методом сприменением реагента фирмы Abcam Inc.
(США). В ходе ферментативной реакциифумаровая кислота (фумарат) под действием сукцинатдегидрогеназы в комплексе свосстановленным флавинадениндинуклеотидом (ФАДH2) восстанавливается до сукцината,при этом ФАДH2 переходит в свою окисленную форму - окрашенное соединение ФАД.Количество образующегося ФАД эквивалентно исходному количеству ФК.Рабочие растворы готовились согласно методикам фирмы–производителя Abcam Inc.(США). При проведении расчетов учитывалась концентрация стандартного растворафумаровой кислоты, который содержится в наборе реактивов. Расчет концентрациифумаровой кислоты в образцах проводился с использованием уравнения:ФК=(А/As)×ФКs,где ФК и ФКs – концентрация фумаровой кислоты в образце и стандарте соответственно, г/л;А и Аs – оптическая плотность раствора образца и стандарта соответственно при длиневолны 450 нм.- янтарной кислотыКонцентрацияянтарнойкислотыопределяласьферментативнымметодомсприменением реагента фирмы Megazyme (Ирландия).
В ходе ферментативной реакциисукцинил-КоА-синтетаза в присутствии АТФ присоединяет янтарную кислоту (сукцинат) ккоферменту А, при этом образуются аденозиндифосфат (АДФ) и неорганический фосфат.Под действием пируваткиназы АДФ реагирует с фосфоенолпируватом с образованиемпируватаиАTФ.Далееникотинамидадениндинуклеотидапируват(НАДН)впод58присутствиидействиемвосстановленногоL-лактат-дегидрогеназывосстанавливается до L-лактата, при этом образуется соединение НАД+, обладающее, вотличие от восстановленной формы, способностью к поглощению УФ-света при длиневолны 340 нм.Количество НАД+, которое образуется в ходе ферментативной реакции, эквивалентноисходному количеству янтарной кислоты.Рабочие растворы готовились согласно методикам фирмы–производителя Megazyme(Ирландия). При проведении расчетов учитывалась концентрация стандартного раствораянтарной кислоты, который содержится в наборе реактивов.
Расчет концентрации янтарнойкислоты в образцах проводился с использованием уравнения:ЯК=(А/As)×ЯКs,где ЯК и ЯКs – концентрация янтарной кислоты в образце и стандарте соответственно, г/л;А и Аs – оптическая плотность раствора образца и стандарта соответственно при длиневолны 340 нм. 2.2.15 Определение содержания ПГАПроцесс экстракции ПГА из биомассы C. necator включал следующие стадии [180]:растворение ПГА в CHCl3 путем перемешивания на термошейкере при 37 0С в течение 12 ч;отделение раствора ПГА от клеточного дезинтеграта фильтрованием; выделение ПГА израствораCHCl3осаждениемизопропиловымспиртом;последующеемногократноерастворение ПГА в CHCl3 и осаждение изопропиловым спиртом; высушивание при 60 0С допостоянной массы и взвешивание.2.2.16 Определение концентрации фурфурола, оксиметилфурфурола и муравьнойкислоты в кислотных гидролизатах биомассы микроводорослей С.
vulgarisАнализсодержанияфурфурола,оксиметилфурфуролаимуравьинойкислоты(продуктов трансформации сахаров) в кислотных гидролизатах биомассы микроводорослейС. vulgaris С-1 проводился с использованием метода ВЭЖХ на хроматографе KnauerSmartline Pump 1000 с УФ-детектором, элюент – 5 мМ раствор серной кислоты, скоростьпотока 0,6 мл/мин, температура термостата колонок 60 оС.2.2.17 Оценка токсичности гидролизатов биомассы микроводорослей C. vulgarisсиспользованием иммобилизованных клеток фотобактерий P. phosphoreumОценка токсичности гидролизатов биомассы микроводорослей C. vulgaris C-1проводилась согласно известному способу [181] с использованием иммобилизованных вкриогель ПВС клеток фотобактерий P.
phosphoreum, полученных в соответствии с известной59методикой [181]. Для анализа токсичности проб к одной грануле с иммобилизованнымиклетками P. phosphoreum, помещенной в кювету люминометра, добавлялось 1000 мкл 2%раствораNaCl.После1-2минуттермостатированиярегистрировалисьпоказанияаналитического сигнала (I0). В другую кювету вносилось 900 мкл 2% раствора NaCl и 100мкл анализируемой пробы. После экспонирования пробы в течение 30 мин сноварегистрировалась величина аналитического сигнала (Iост). На основе полученных данныхрассчитывалось тушение сигнала биолюминесценции как процентное отношение разницы I0и Iост к I0.2.2.18 Определение кинетических параметров процессовПри проведении расчетов предполагалось, что изучалась закрытая (периодическая)система, в которой существенные для роста компоненты в процессе роста клеток непоступали в систему дополнительно и не покидали ее в течение каждого цикла. В закрытойсистеме скорость роста клеток в конечном итоге стремится к нулю либо из-за недостаткасубстрата, либо из-за ингибирования продуктом при его дальнейшем накоплении [182].С учетом вышеизложенного положения удельная скорость роста () клетокпредставляет собой скорость роста единицы популяции:dС/dt = ×С,где t – время роста культуры, сут или ч;С – концентрация клеток в момент времени t, г/л; – удельная скорость роста клеток, сут-1 или ч-1.На участке экспоненциального (логарифмического) роста удельная скорость ростапостоянна, она определялась из уравнения:lnС = lnС0 + ×t,где С0 – начальная концентрация клеток, г/л.Закон постоянного экспоненциального роста выполняется, если условия окружающейсреды и состав биомассы остаются постоянными.
Если скорость роста не подчиняется этомузакону, то не выполняется, либо одно, либо оба из вышеперечисленных условий.Показатели конверсии субстрата Yi рассчитывались по формуле:nYi =j 1Mjnj 1Sj=M,Sгде i – условное обозначение соответствующего коэффициента конверсии;j = 1…..n – число циклов, в течение которых происходила трансформация субстрата;М – концентрация конечного продукта трансформации субстрата, г/л;60S – концентрация субстрата, потребленного в процессе культивирования клеток г/л.Скорости накопления Qi (скорость накопления продукта Qp (продуктивностьпроцесса по продукту), г/л/ч, и скорость накопления биомассы клеток (продуктивностьпроцесса по биомассе) Qc, мг сух.
в-в/л/сут или мг сух. в-в/л/ч) рассчитывались по формулам:Qp = Р/t,Qc = С/t,где Р – концентрация продукта в момент времени t, г/л,С – концентрация клеток в момент времени t, мг сух. в-в/л.Продуктивность биокатализатора была рассчитана по формуле:П кат P (V реакт Vгран )t mкат 1000 ,где Пкат. – продуктивность биокатализатора, (г P/ч/кг сух. в-в биокатализатора),t – время проведения процесса, ч,P – концентрация продукта, накопившаяся в среде за время t, г/л,Vреакт – объем среды в реакторе, л,Vгран – обьем среды в гранулах, л,mкат – масса гранул катализатора в реакторе, г сух.
в-в.При обработке всех экспериментальных данных рассчитывались средние значения изначения стандартных отклонений. Все эксперименты проводились не менее, чем в трехповторностях.61ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Исследование процесса накопления биомассы клеток микроводорослей C. vulgaris всточных водах разного составаРанее уже было отмечено (см. п. 1.1), что использование сточных вод, богатыхбиоорганическими соединениями, которые могут быть использованы в качестве питательныхсред для культивирования микроводорослей, является весьма перспективным, посколькупозволяет объединить технологии биологической очистки вод и накопления биомассымикроводорослей, являющейся ценным сырьем для получения различных промышленныхпродуктов.
Следует, однако, отметить, что не все виды микроводорослей способны расти всреде сточных вод. Самыми перспективными, как уже было отмечено ранее (см. п.1.1),являются микроводоросли рода Chlorella. Целью данной части работы является разработка иисследование возможностей применения нового подхода к осуществлению процессанакопления биомассы клеток микроводорослей C. vulgaris в сточных водах разного состава.3.1.1 Культивирование свободных клеток микроводорослей С.
vulgaris в сточных водахНа первом этапе исследований был проведен скрининг и изучены кинетическиепараметры процесса накопления биомассы различных образцов на примере клеток зеленыхмикроводорослей C. vulgaris с целью выбора штамма с высокой удельной скоростью роста(µ) и высокими значениями продуктивности (скорости) процесса по биомассе (QС).В первую очередь был проведен выбор наиболее продуктивного по биомассе илучшего по удельной скорости роста штамма микроводорослей C. vulgaris среди 5 культур(Таблица 9), полученных из разных коллекций РФ.
Использовалась для этого питательнаясреда Тамийя с добавлением 5 г/л глюкозы (см. п. 2.2.1).Таблица 9 – Значения удельной скорости роста клеток (µ) и средней скорости накоплениябиомассы (QC) исследуемых штаммов микроводорослей C. vulgaris в питательной средеТамийя с добавлением 5 г/л глюкозыШтаммµ, сут-1QC, мг сух. в-в/л/сутС-10,42±0,02306±10С-20,36±0,01149±5С-70,29±0,0186±3С-750,37±0,01152±6С-820,34±0,01134±562Как видно из Таблицы 9, наибольшими значениями удельной скорости роста клетоки скоростью накопления биомассы характеризовался штамм C. vulgaris С-1, в связи с чемименно он использовался в дальнейших экспериментах.Далее была исследована кинетика накопления биомассы свободных клеток C.
vulgarisС-1 (для удобства в дальнейшем обозначение штамма указываться не будет) в сточных водахразличного состава (Рисунки 3, 4). Для проведения исследований были выбраны наиболеераспространенные и значимые с практической точки зрения разновидности сточных вод:пищевого производства, агропромышленного комплекса и бытовых стоков. При этом былииспользованы как модельные среды, так и сточные воды реальных производственныхпредприятий, предоставленные по запросу МГУ имени М.В. Ломоносова (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
