Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации (1105654), страница 9
Текст из файла (страница 9)
vulgaris в процессе очистки сточных вод разного состава содновременным снижением уровня их загрязнения (ХПК).2. усовершенствовать подходы к предобработке биомассы C. vulgaris для получения сред смаксимально высокими концентрациями ВС.3. определить наиболее эффективные подходы к получению органических кислот и ПГА прииспользовании сред, получаемых в результате эффективной деструкции биомассымикроводорослей C. vulgaris.Именно в этих направлениях и развивались научные исследования, предпринятыедалее в этой работе.43ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1 Материалы2.1.1 Химические реактивыРеактивы (Химмед): мочевина, ч., ацетат натрия 3-водный, ч.д.а., хлорид аммония,ч.д.а., дигидроортофосфат калия ч.д.а., сульфат железа 7-водный х.ч., хлорид кальция, ч.,гидрокарбонат натрия х.ч., хлорид железа 6-водный, ч.,сульфат аммония, ч., сульфатцинка 7-водный, х.ч., сульфат меди 5-водный, х.ч., хлорид натрия ч., сульфат цинка 7водный, х.ч., нитрат кобальта 6-водный ч.д.а., гидроортофосфат калия 3-водный ч.д.а.,карбонат натрия х.ч., глюкоза, ч., молибдат аммония, ч.д.а., сульфат ртути, х.ч., сульфатсеребра, х.ч., диметилсульфоксид (ДМСО), ч., дихлорметан, ч., концентрированная сернаякислота, х.ч., нитрат аммония, ч., бихромат калия, ч., молибдат аммония 4-водный, ч.д.а.,арсенат натрия 7-водный, х.ч.Реактивы (Реахим): нитрат хрома 9-водный, ч., хлорид меди 2-водный, ч., сульфатникеля 7-водный, х.ч., хлорид свинца, ч., хлорид цинка, ч., сахароза, ч.д.а., сульфат магния7-водный, ч.д.а., сульфат калия, ч., хлорид кобальта 6-водный, ч, тетраборат натрия 10водный, ч.д.а., молибдат натрия 2-водный, ч.д.а., нитрат никеля 6-водный, ч.д.а., борнаякислота, ч.д.а., хлорид марганца 4-водный, ч.д.а., нитрат натрия, ч., гидроортофосфатнатрия,ч.д.а.,хлороформ,ч.д.а.,концентрированнаяуксуснаякислота,о.с.ч.,концентрированная азотная кислота ч.д.а., гидроксид натрия, х.ч., сульфат натрия ч.д.а.,изопропиловый спирт, х.ч., карбонат магния, ч.д.а.Реактивы (Sigma) марки ч.д.а.: лимонная кислота, биотин, метанол, краситель«Нильскийкрасный»,додецилсульфатнатрия,целлюлозамикрокристаллическая,[Bmim]Cl (1-бутил-3-метилимидозолий хлорид).Остальные реактивы: TRIS (Трис[гидроксиметил]аминометан) (ICN Pharmaceuticals),триптон и дрожжевой экстракт (Difco), поливиниловый спирт марки 16/1 (средняя ММ 84кДа, степень деметилирования 99%, ЕрмакХим (Россия)), этилендиаминтетрауксуснаякислота (ЭДТА) ч.д.а.
(Merck), антрон, ч.д.а., гидроксид калия ч.д.а. (Лабтех), крахмал(картофельный “высшего сорта”, Белынический крахмальный завод, Беларусь, ГОСТ 769978).Коммерческие препараты ферментов: Cellulase (Trichoderma viride) (Sigma), α-amylase(Aspergillus oryzae) (Sigma), pectinase (Aspergillus niger) (Sigma), сhitinase (Trichoderma viride)(Sigma),endo-1,4β-mannanase(Aspergillusniger)(Megazyme),endo-1,4-β-xylanase(Trichoderma viride) (Megazyme).Аналитические наборы для определения концентрации химических веществ:Фотоглюкоза 2/4 (Импакт, Россия), Иммолюм (Люмтек, Россия), Lactate Dry-Fast (Sentinel,44Италия), Fumarate detection kit (Abcam, Англия), Succinic Acid Assay Kit (Megazyme,Ирландия), Total Starch Assay Kit (Megazyme, Ирландия).Образцы сточных вод, используемые в работе: сточная вода Останкинского СовхозаДекоративного Садоводства (г. Москва), сточная вода Останкинского Молочного Комбината(г.
Москва).2.1.2 ПриборыКультивированиеклетокмикроводорослейосуществлялосьприосвещениилюминесцентными лампами Osram Fluora 77 (30 Вт) (Германия)Культивирование клеток мицелиальных грибов и бактерий проводилось натермостатируемом шейкере-инкубаторе «Adolf Kuhner AG» (Швейцария) и «BioSan ES-20»(Литва).Для отделения клеток от среды культивирования использовались центрифугиBeckman J-2-21 (США) и Eppendorf centrifuge 5415R (Германия).Спектрофотометрические исследования проводились на спектрофотометре «AgilentUV-853» (Германия), оборудованном термостатируемой ячейкой.Определение внутриклеточной концентрации АТФ проводилось с использованиеммикролюминометра New Horizons diagnostics Co., MODEL 3560 (США).Механическая дезинтеграция биомассы микроводорослей проводилась на шаровоймельнице Mini-Beadbeater-24 (США).Для наблюдения за клетками микроорганизмов использовался световой микроскопБиомед (Россия) с насадкой БиомедЛюм206070112209 и цифровой камерой для микроскопаMyscope 500M.Перемешивание растворов осуществлялось на Термошейкере Biosan TS-100 (Латвия).Взвешивание образцов осуществлялось на весах: электронных лабораторных CASMWP (Корея) и аналитических Mettler Toledo ML (Швейцария).Высушивание образцов проводилось в сухожаровом шкафу ШС-80-01 СПУ (Россия).Значения pH приготовленных сред и отбираемых в процессе экспериментов пробконтролировались с помощью pH-метра Corning Pinnacle 530 (Швейцария).Дляпроведенияферментативногогидролизабиомассымикроводорослейиспользовался термостат Binder (США).Для аналитических исследований использовался жидкостной хроматограф KnauerSmartline Pump 1000 (Германия) с УФ-детектором, газовый хроматограф ЛХМ 8 МД - модель3 (Россия) с катарометром и хромато-масс-спектрометр Trace 1300 ISQ (Thermo FisherScientific, США).45Определение уровня биолюминесценции клеток фотобактерий проводилось налюминометре 1250 LKB-Wallac (Швеция).Термическая обработка жидких сред (стерилизация) осуществлялась в Стерилизаторепаровом ВК-75-01 (Россия).2.1.3 МикроорганизмыВ работе использовались клетки зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris C-1,C.
vulgaris C-2, C. vulgaris C-7, C. vulgaris C-75, C. vulgaris C-82, Nannochloropsis sp. штаммrsemsu–N-1, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Cosmarium sp., Dunaliella salina Teod.штамм rsemsu-D-1, клетки красных микроводорослей Galdieria partita Sentz.штамм rsemsu-G3, Haematococcus pluvialis, клетки диатомовых микроводорослей Thalassiosira weissflogii,клетки цианобактерий Arthrospira / Spirulina platensis (NORDST.) GEITL. штамм 1/02-П,Nostoc sp., Gloeotrichia echinulata, полученные из Коллекции института физиологии растенийим.
К.А. Тимирязева РАН, Коллекции института биохимической физики им. Н.М. ЭмануэляРАН,КоллекцииБиологическогоиГеографическогофакультетовМГУим. М.В. Ломоносова.В работе использовались штаммы мицелиальных грибов Rhizopus oryzae F-814,R. oryzae F-1032, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов(ВКПМ).В работе использовались штаммы бактерий Actinobacillus succinogenes B-10111,Cupriavidus necator B-8619, полученные из ВКПМ и Photobacterium phosphoreum КМ МГУ№311, полученные из Коллекции микроорганизмов МГУ.2.1.4 Источники углеводсодержащего сырья, использованного в работеВ качестве сырья в работе использовались:- биомасса фототрофных микроорганизмов (п. 2.1.3);- биомасса макроводорослей: Laminariae saccharina (ОАО Красногорсклекарства, Р№ЛС-001856 от 30.12.2011), Asparagopsis taxiformis, Ulva lactuca (собраны на побережьеВьетнама и идентифицированы в Институте Химии Вьетнамской Академии наук);-образцы целлюлозосодержащих отходов (ЦСО): свекловичный жом (ЭкспоДон,Ростов-на-Дону, Россия), пшеничная солома (Место скоса - Тульская область, Россия),осиновые, березовые и сосновые опилки (ЗАО Боровичи-Мебель, г.
Боровичи, Россия),клубни и стебли топинамбура (ООО Эспланада-Южная, Краснодарский край, Россия),рисовая солома, багасса (GIA GIA NGUYEN CO, LTD, Вьетнам).462.2 Методы2.2.1 Культивирование клеток различных микроорганизмов-клеток фототрофных микроорганизмов:Культивирование клеток микроводорослей C.
vulgaris осуществлялось на средеТамийя [165] с добавлением 5 г/л глюкозы, модельных питательных средах, имитирующихбытовые сточные воды и сточные воды пищевой промышленности и реальных сточныхводах Останкинского Молочного Комбината (г. Москва) и Останкинского СовхозаДекоративного Садоводства (г. Москва).Состав модельной питательной среды, имитирующей бытовые сточные воды (Сточнаявода №1) (мг/л) [166]: CO(NH2)2 – 91,7, CH3COONa×3H2O – 131,6, триптон – 17,4,дрожжевой экстракт – 52,2, крахмал – 122,0, молочный порошок – 116,2, масло подсолнечное– 29,0, NH4Cl – 12,8, MgHPO4×3H2O – 29,0, KH2PO4 – 23,4, FeSO4×7H2O – 5,8, раствормикроэлементов – 1 мл.
Раствор микроэлементов содержит (мг/л): Cr(NO3)3×9H2O – 770,CuCl2×2H2O – 536, MnSO4×H2O – 108, NiSO4×6H2O – 336, PbCl2 – 100, ZnCl2 – 208 (pH 7,1).Состав модельной питательной среды, имитирующей сточные воды пищевойпромышленности (Сточная вода №2) (мг/л) [167]: сахароза – 1282, крахмал – 173,6, CaCl2 –185,0, MgSO4×7Н2О – 252,8, K2SO4 – 1063, NaHCO3 – 128,9, FeCl3×6H2O – 7,1, KH2PO4 – 17,5,(NH4)2SO4 – 72,3, раствор микроэлементов – 1 мл.
Раствор микроэлементов содержит (мг/л):MnSO4×H2O – 350,9, ZnSO4×7H2O – 879,7, CuCl2×2H2O – 268,2, CoCl2 – 44,1, Na2B4O7×10H2O– 352,8, Na2MoO4×2H2O – 25,2, NiNO3×6H2O – 346,9 (pH 7,0).Состав сточных вод Останкинского Совхоза Декоративного Садоводства (Сточнаявода №3) (мг/л): ХПК – 990, N-NH4 – 41,4, N общ – 52,5; P общ – 8,8 (рН 7,2).Состав сточных вод Останкинского Молочного Комбината (Сточная вода №4) (мг/л):ХПК – 1610, N-NH4 – 34,6, N общ – 61,5, P общ – 10,6 (рН 7,6).Культивирование клеток микроводорослей Dunaliella salina Teod. штамм rsemsu-D-1осуществлялось на среде Семененко-Абдуллаева [165], микроводорослей Nannochloropsis sp.штамм rsemsu–N-1, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Cosmarium sp.
и цианобактерийNostoc sp. – на среде BG-11 [165], микроводорослей Galdieria partita Sentz.штамм rsemsu-G-3– на среде Аллен [165], микроводорослей Haematococcus pluvialis – на среде ОНМ [165],микроводорослей Thalassiosira weissflogii – на среде f/2 [165], цианобактерий Arthrospira /Spirulina platensis (NORDST.) GEITL. штамм 1/02-П – на среде Заррука [165], цианобактерийGloeotrichia echinulata – на среде ZG-11 [165].Культивирование фототрофных микроорганизмов проводилось в аэробных условияхпри температуре 25 ○C в режиме круглосуточного освещения люминесцентными лампами.Соотношение жидкой и газовой фаз в мини-реакторе составляло 0,2.47-клеток мицелиальных грибов:Культивирование клеток мицелиальных грибов R. oryzae F-814, R. oryzae F-1032осуществлялось на среде следующего состава (г/л): глюкоза – 100, (NH4)2SO4 – 2,36,MgSO4×7H2O – 0,2, ZnSO4×7H2O – 0,07, K2HPO4×3 H2O – 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
