Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации (1105654), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Культивирование проводилось ваэробных условиях с постоянным перемешиванием (180 об/мин) при температуре 28 ○С.Соотношение жидкой и газовой фаз в мини-реакторе составляло 0,2.-клеток бактерий:Культивирование клеток бактерий A. succinogenes B-10111 с целью накопления ихбиомассы осуществлялось на «среде роста» (г/л): глюкоза – 20; дрожжевой экстракт – 5,NaHCO3 – 10, NaH2PO4×2Н2О – 8,5, KH2PO4 – 15,5; с целью накопления ЯК на «рабочейсреде» (г/л): глюкоза – 50, дрожжевой экстракт – 5, KH2PO4 – 3,0, MgCl2×6H2О – 0,2, СaCl2 –0,2, NaCl – 1.
Культивирование проводилось в анаэробных условиях с постояннымперемешиванием (180 об/мин) при температуре 37 0С. Соотношение жидкой и газовой фаз вмини-реакторе составляло 0,5. Значение рН устанавливалось на уровне 6,8±0,2 прииспользовании 2 М раствора Na2CO3. Для поддержания pH 6,8±0,2 использовался MgCO3 вконцентрации 25 г/л.Культивирование клеток бактерий C. necator В-8619 осуществлялось на Средах 1-4.Состав Среды-1 (г/л): глюкоза – 20, (NH4)2SO4 – 4, KH2PO4 – 13,3, MgSO4×7H2O – 1,2,лимонная кислота – 1,7, раствор микроэлементов – 10 мл.
Раствор микроэлементов содержит(г/л в 0,1 М HCl): FeSO4×7H2O – 10, ZnSO4×7H2O – 2,25, CuSO4×5H2O – 1,0, MnSO4×4H2O –0,5, CaCl2×2H2O – 2,0, H3BO4 – 0,3, (NH4)6Mo7O24 – 0,1. Составы Сред 2, 3 и 4 аналогичнысоставу Среды-1 за исключением того, что в них вместо (NH4)2SO4 вводились CO(NH2)2,NH4Cl и NH4NO3 соответственно.
Культивирование проводилось в аэробных условиях спостоянным перемешиванием (180 об/мин) при температуре 28 0С. Соотношение жидкой игазовой фаз в мини-реакторе составляло 0,2. Для поддержания рН 7,0±0,2 использовался 2 Мраствор КОН.КультивированиеклетокфотобактерийP.phosphoreumКММГУ№311осуществлялось на среде Фаргали с добавлением дрожжевого экстракта и пептона [168].2.2.2Иммобилизация микроорганизмов в криогель поливинилового спирта- Иммобилизация клеток фототрофных микроорганизмовДляпроведенияиммобилизацииклеткимикроводорослейC.vulgarisC-1культивировались в среде Тамийя до конца экспоненциальной фазы роста, накопленнаябиомасса клеток осаждалась центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин), далее осадоквлажной биомассы смешивался с 5-20%-ным раствором ПВС, приготовленном на среде48Тамийя или стерильной водопроводной воде так, чтобы содержание в смеси сухой биомассысоставило 4%, и ресуспендировался до получения гомогенной суспензии клеток. Дляформирования гранул приготовленная смесь с помощью стерильного шприца или пипеткинаносилась на охлажденную поверхность в виде мелких капель.
Полученный материалпомещался в морозильную камеру при -70 0С и хранился при этой же температуре вгерметичных условиях. Размораживание проводилось в 2 этапа: образцы выдерживалисьоколо 3-х часов при -20 0С и далее при +7 0С в течение такого же периода.Иммобилизация клеток других фототрофных микроорганизмов осуществляласьаналогичным образом.-Иммобилизация спорового материала грибных культурИммобилизация спорового материала грибных культур осуществлялась согласноизвестному способу [169]: 95 мл суспензии спор в физиологическом растворе сконцентрацией 5×106 кл/мл ресуспендировалось в 1050 г 12 % водного раствора ПВС дополучениягомогеннойсуспензии.ДляформированиягранулкриогеляПВСсиммобилизованными спорами приготовленная смесь с помощью стерильного шприцараспределялась по ячейкам 96-луночных планшетов, которые помещались в морозильнуюкамеру при -18 оС и выдерживались при этой же температуре.
Размораживание образцовпроводилось при +7 0С в течение 3-х часов.-Иммобилизация клеток бактерийДляпроведенияиммобилизацииклеткибактерийA.succinogenesB-10111культивировались в среде роста до конца экспоненциальной фазы роста, накопленнаябиомасса клеток осаждалась центрифугированием (8000 об/мин, 15 мин), далее осадоквлажной биомассы смешивался с 10-15%-ным раствором ПВС, приготовленном на среде, вкоторой культивировались клетки, так, чтобы содержание в смеси сухой биомассы составило1-3%, и ресуспендировался до получения гомогенной суспензии клеток. Для формированиягранул приготовленная смесь с помощью стерильного шприца распределялась по ячейкам96-луночных планшетов. Полученный материал помещался в морозильную камеру при -70оС и хранился при этой же температуре. Размораживание проводилось в 2 этапа: образцывыдерживались около 3-х часов при -20 0С и далее при +7 0С в течение такого же периода.2.2.3 Анализ состава биоорганических компонентов биомассы клеток микроорганизмов2.2.3.1 Определение сухого веса (влажности) биомассы клеток микроорганизмовОпределение сухого веса биомассы клеток проводилось согласно известной методике[170].
Стеклянные бюксы помещались в сушильный шкаф и сушились в течение 2 ч притемпературе 110С. Затем бюксы вынимались пинцетом из сушильного шкафа и49переносились в эксикатор с безводным CaCl2. Через 1 ч бюксы взвешивались с точностью до0,1мг.Высушиваниеивзвешиваниеповторялосьссоблюдениемуказаннойпоследовательности операций, пока масса не достигала постоянного значения, то естьколебания в ее определениях не превышали ± 0,1 мг.2.2.3.2 Определение содержания липидовПеред определением липидов и их экстракцией влажная биомасса клетокмикроогранизмов подвергалась термообработке на водяной бане при 100оС в течение 10 мин.Экстракция липидов из предобработанной биомассы осуществлялась по методу Фольша[171].Определение липидов проводилось спектрофлуорометрически (по взаимодействию сфлуоресцентным красителем Нильский красный).
Для спектрофлуорометрического анализа вкювету, содержащую 2 мл 50 мкМ Нильского красного в ДМСО, добавлялось 10 мкланализируемого раствора органической фазы и определялась интенсивность флуоресценциипри длине волны 635 нм, возбуждаемой светом с длиной волны 485 нм.В аналогичных условиях определялось изменение интенсивности флуоресценции длярастворов с известной концентрацией липидов.
Масса экстрагированных липидоврассчитывалась с использованием опредёленной концентрации и известного объёмаорганической фазы. Определение, включая стадию экстракции, проводилось в трёхповторностях.2.2.3.3 Определение содержания белковОсадки биомассы клеток микроогранизмов после экстракции липидов высушивалисьпри 50 оС в течение 20 ч и затем взвешивались.Экстракция белка проводилась добавлением к осадку 1 мл 4% додецилсульфата натрияв 0,1 М TRIS-HCl буфере (рН 8,5).
Осадки ресуспендировались, выдерживались натермошейкере при 60 оС и 1400 об/мин. в течение 30 мин. и центрифугировались (13200об/мин., 5 мин). Экстракция проводилась 2–3 раза, после чего определялась концентрациябелка в суммарном экстракте по оптической плотности растворов при длине волны 260 и 280нм с использованием следующей формулы [172]:C ( мг / мл) 1,55 A260 - 0,76 A280(1)Масса белков рассчитывалась согласно определённой концентрации и известномуобъёму экстракта.
Определение, включая стадию экстракции, проводилось в трёхповторностях.502.2.3.4 Определение содержания углеводовОсадки биомассы клеток микроогранизмов после экстракции белка высушивались прио60 С в течение 20 ч, а затем взвешивались. К навеске осадка добавлялось 100 мкл воды и 1,9мл конц. H2SO4. После этого полученная смесь выдерживалась на термошейкере при 60 оС и1400 об/мин. до полного растворения осадка. Перед определением аликвота полученногогидролизата разбавлялась в 100–200 раз.Определение общего содержания углеводов в белковом экстракте и гидролизате осадкапроводилось с использованием фенольного метода [173]. Для этого к 0,16 мл анализируемойпробы добавлялось 0,16 мл 5% водного раствора фенола, а затем 0,8 мл H2SO4 (конц.).Полученная смесь перемешивалась.
Через 10–20 мин. пробы охлаждались до комнатнойтемпературы, и в них определялась оптическая плотность при длине волны 490 нм.В качестве стандарта использовался водный раствор глюкозы с концентрацией 10–180мкг/мл. Содержание углеводов рассчитывалось путем суммирования растворимой инерастворимой составляющих. Определение проводилось в трёх повторностях.2.2.3.4.1 Определение содержания целлюлозы в биомассе микроводорослей С. vulgarisЭкстракция целлюлозы и определение ее содержания в биомассе микроводорослейC. vulgaris C-1 проводились по методу Апдеграфа [174, 175].2.2.3.4.2 Определение содержания крахмала в биомассе микроводорослей С.
vulgarisСодержание крахмала в биомассе микроводорослей C. vulgaris C-1 определялосьферментативным методом с применением реагентов фирмы Megazyme (Ирландия) [176].Согласно инструкции производителя, в ходе ферментативной реакции термостабильнаяα-амилаза гидролизует крахмал в растворимые мальтодекстрины.
Далее глюкоамилазагидролизует мальтодекстрины в D-глюкозу. D-глюкоза под действием глюкозооксидазыокисляется в глюконовую кислоту, при этом образуется эквимолярное количество H2O2. ПоддействиемпероксидазыH2O2окисляет4-аминоантипиринвприсутствии4-гидроксибензойной кислоты в окрашенное соединение (хинонимин), интенсивность окраскикоторого пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемом образце и измеряетсяспектрофотометрически при длине волны 510 нм. 2.2.4 Определение концентрации внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методомВыживаемостьклетокмикроорганизмовконтролироваласьопределениемконцентрации внутриклеточного АТФ. В свою очередь, концентрация АТФ определяласьлюциферин-люциферазнымметодомсиспользованием51стандартногореагента,разработанного на кафедре химической энзимологии МГУ имени М.В.
Ломоносова [177].Схема биолюминесцентной реакции выглядит следующим образом:NESSHOHNHCOOHATPHMg2+E*HONNSSHCOOH* AMPHPPiHлюциферинE*HONNSSHCOOH* AMP O2, -CO2HHNNOAMP hvESHOSоксилюциферингде: Е – люцифераза; РРi – неорганический пирофосфат; ATP – внутриклеточный АТФ, AMP– аденозинмонофосфат, h - квант света.Квантовыйвыходреакцииравен1.Приобразованииодноймолекулыоксилюциферина выделяется 1 квант света, что и определяет высокую чувствительностьметода. Он позволяет определить концентрацию АТФ до 10-12-10-14М. Скорость реакциипропорциональна интенсивности излучаемого света (измеряется с помощью люминометра).Концентрация внутриклеточного АТФ в свободных клетках микроорганизмовопределялась следующим образом: к 0,1 мл клеточной суспензии добавлялось 0,9 мл ДМСО.В полученном экстракте анализировалось содержание АТФ.Экстракция АТФ из клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, проводиласьследующим образом: гранулы биокатализатора подсушивались 20-30 секунд при комнатнойтемпературе, взвешивались, заливались 1 мл ДМСО и нагревались в течение несколькихсекунд до температуры 70-80 °С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
