Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации (1105654), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Экспериментальный подбор строго определеннойконцентрации раствора полимера для приготовления на его основе суспензии клеток иформирования криогеля ПВС обеспечивает такую пористость матрицы, при которойпроисходитнезатрудненныймассообменвеществ,обеспечивающийклеткивсемнеобходимым для их роста и выхода нарастающих клеток из крупных пор матрицы в средупри культивировании клеток после криоконсервации [189].68Было исследовано влияние концентрации раствора ПВС на характеристикиполучаемогоэкспериментахобразцасиммобилизованныхцельюопределенияклетокмикроводорослейоптимальнойконцентрацииC.vulgaris.раствораВПВС,используемого для иммобилизации клеток Chlorella, была проварьирована концентрацияполимера в диапазоне 10÷20%. Для приготовления растворов полимера были использованыпитательная среда Тамийя, специфичная для выращивания клеток микроводорослей родаChlorella, и стерильная водопроводная вода с добавлением в каждом случае криопротекторав оптимальной для процессов иммобилизации в криогель ПВС концентрации - 3% глицерина[181] и без такового.
Как известно, применение в качестве основы для получения растворовПВС различных сред, а также введение добавок питательных веществ в состав образцовгранул с иммобилизованными клетками может существенно повлиять на сохранение ихжизнеспособности в процессе иммобилизации [190]. 4%-ная концентрация клеток (по сухимвеществам) в растворе полимера была использована в этих экспериментах, так как известно,что при хранении биомассы различных микроорганизмов, иммобилизованных в криогельПВС, максимальную жизнеспособность клеток обеспечивает именно такая их концентрацияв формирующихся гранулах [71]. Для формирования криогеля ПВС было решенозамораживать и выдерживать образцы иммобилизованных клеток микроводорослей при-700С.
Из литературных данных известно, что снижение температуры ниже -80оС приводит ктому, что структурирование криогеля ПВС сопровождается получением в конечном итогематрицы с порами меньшего размера [191], что затрудняет выход клеток из состояниякриоконсервации, лимитирует массообменные процессы, делает практически невозможнымвыход клеток из матрицы носителя и их использование в качестве инокулята.
В своюочередь, проведение процесса иммобилизации клеток при температуре выше -70°С приводитк уменьшению скорости замораживания [188] суспензии клеток и в результате к понижениюуровня их выживаемости в процессе криохранения. В качестве основного параметра,отражающего энергетический статус клеток и суммарно характеризующего физиологическоесостояние клеток в полученных образцах гранул, контролировалась концентрациявнутриклеточного АТФ на всех этапах проведения процесса иммобилизации (Таблица 11).Все полученные образцы иммобилизованных клеток культивировались в сточной воде№2, богатой сахарозой (концентрация иммобилизованных клеток C. vulgaris в среде была 0,4г сух.
в-в/л). В ходе культивирования наряду с концентрацией внутриклеточного АТФ виммобилизованных клетках C. vulgaris этот же параметр определялся и в культуральнойжидкости (Таблица 11), чтобы оценить способность клеток к пролиферации после ихиммобилизации в криогель ПВС (криоконсервирования).69Таблица 11 – Изменение концентрации внутриклеточного АТФ (×10-7 моль/г сух. в-в) в препарате иммобилизованных в криогель ПВСклеток C. vulgaris в ходе их иммобилизации, хранения и культивирования в сточной воде № 2 (концентрация иммобилизованных клетокC. vulgaris в среде 0,4 г сух.
в-в/л), а также в культуральной жидкости (×10-10 моль/мл) в зависимости от концентрации ПВС в исходномраствореКонцентрация раствора ПВС, %20Среда для приготовления раствора ПВСДобавки15Стерильная водопроводная вода3% глицеринаСреда ТамийяБез добавокАТФ клеток до смешения с раствором ПВСАТФ в суспензии клеток в растворе ПВС103% глицерина29,31 ± 1,172,45 ± 0,09Время хранения при -700С, сут2,55 ± 0,102,82 ± 0,123,99 ± 0,169,73 ± 0,419,96 ± 0,35АТФ в иммобилизованном препарате в результате криохранения7020,81 ± 0,030,45 ± 0,010,94 ± 0,042,42 ± 0,109,02 ± 0,369,42 ± 0,35240,86 ± 0,030,55 ± 0,020,82 ± 0,031,00 ± 0,039,11 ± 0,349,43 ± 0,34530,91 ± 0,040,54 ± 0,020,71 ± 0,030,60 ± 0,029,12 ± 0,339,35 ± 0,295500,15 ± 0,010,05 ± 0,010,19 ± 0,010,43 ± 0,028,99 ± 0,409,12 ± 0,31Время культивирования в сточной воде №2, сутАТФ в иммобилизованном препарате40,91 ± 0,030,66 ± 0,031,08 ± 0,042,18 ± 0,089,91 ± 0,4110,18 ± 0,4180,75 ± 0,020,53 ± 0,020,67 ± 0,031,58 ± 0,069,56 ± 0,409,99 ± 0,35АТФ в культуральной жидкости40,52 ± 0,020,81 ± 0,030,91 ± 0,042,33 ± 0,147,98 ± 0,218,12 ± 0,1981,02 ± 0,040,92 ± 0,041,82 ± 0,076,12 ± 0,2214,91 ± 0,3915,01 ± 0,41На основании анализа данных Таблицы 11 был сделан ряд следующих выводов:- использование для приготовления раствора ПВС стерильной водопроводной водыявляется нежелательным, так как уже на стадии смешивания биомассы клеток C.
vulgaris стаким раствором полимера наблюдается сильное снижение концентрации внутриклеточногоАТФ;- введение в состав иммобилизованного препарата глицерина не играет определяющейроли в сохранении жизнеспособности клеток;- наилучшей концентрацией раствора полимера, используемого для приготовленияобразцов иммобилизованных клеток C. vulgaris, подлежащих криоконсервированию, с точкизрения уровня их выживания и одновременно способности служить инокулятом дляполучения свободной биомассы клеток микроводорослей при дальнейшем переносе их впитательную среду, является концентрация 10%;-иммобилизациявкриогельПВСпозволяетдлительнохранитьклеткимикроводорослей C. vulgaris в замороженном виде (не менее 550 сут), обеспечивая при этомсохранение у них достаточно высокого энергетического уровня (концентрация АТФ).Однако использование для иммобилизации клеток C.
vulgaris раствора ПВС сконцентрацией 10% и выше, очевидно, приводит к формированию прочной матрицы сразмером пор, не позволяющим клеткам после размораживания и переноса в питательныесреды выступать в качестве хорошего инокулята, так как новые генерации клеток не могутсвободно покинуть матрицу через сформированные поры.С учетом вышесказанного было решено проварьировать концентрации раствора ПВС,используемого для иммобилизации клеток микроводорослей, в более узком интервале 5÷8%.Полученные образцы иммобилизованных клеток также культивировались в сточнойводе №2 (исходная концентрация иммобилизованных клеток C.
vulgaris в среде - 0,4г сух. в-в/л). В ходе процесса контролировалась концентрация внутриклеточного АТФ дляиммобилизованных и накапливающихся в культуральной жидкости свободных клетокC. vulgaris, также определялась концентрация биомассы свободных клеток, рассчитываласьскорость накопления биомассы C. vulgaris (Таблица 12, Рисунки 8, 9).Из полученных данных следует, что оптимальной концентрацией носителя дляприготовленияобразцовиммобилизованныхклетокC.vulgaris,подлежащихкриоконсервированию, как с точки зрения их выживаемости, так и способности служитьхорошим инокулятом для получения биомассы свободных клеток микроводорослей придальнейшем переносе их в питательные среды является концентрация 7%.
Большаяконцентрация полимера, вероятно, приводила к формированию матрицы с меньшимразмером пор, что усложняло выход клеток из носителя в среду.71Таблица 12 – Изменение концентрации внутриклеточного АТФ (×10-7 моль/г сух. в-в) впрепарате иммобилизованных в криогель ПВС клеток C. vulgaris в ходе их иммобилизации,хранения и последующего культивирования в сточной воде № 2 (концентрацияиммобилизованных клеток C. vulgaris в среде 0,4 г сух. в-в/л), а также АТФ в культуральнойжидкости (×10-10 моль/мл) в зависимости от концентрации ПВС в исходном раствореКонцентрация раствора ПВС,%5678АТФ в суспензии клеток в растворе ПВС15,1 ± 0,613,9 ± 0,612,9 ± 0,611,9 ± 0,711,8 ± 0,310,2 ± 0,311,9 ± 0,511,0 ± 0,511,1 ± 0,311,2 ± 0,412,5 ± 0,611,4 ± 0,67,9 ± 0,213,2 ± 0,319,0 ± 0,511,7 ± 0,2АТФ в иммобилизованном препаратечерез 3 сут хранения при -70 0САТФ в иммобилизованном препаратечерез 3 сут культивированияАТФ в культуральной жидкости через3 сут культивирования Рисунок 8 – Кинетика накопления биомассы свободных клеток C.
vulgaris в сточной воде №2(см. п. 2.2.1) при концентрациях ПВС в растворе, используемом для полученияиммобилизованного препарата на основе клеток C. vulgaris, 5 (■), 6 (▲), 7 (●), 8 (♦) %(концентрация иммобилизованных клеток C. vulgaris в среде 0,4 г сух. в-в/л)Снижение концентрации полимера ниже 7% способствовало формированию матрицы,предположительно, с более крупными порами, через которые клетки легко могли выходитьиз носителя в среду и выполнять роль инокулята, но при этом снижалась степеньвыживаемости клеток при замораживании/оттаивании и их криохранении, поскольку,72очевидно, уменьшалась криопротекторная эффективность самого ПВС в результатеснижения его концентрации в микроокружении клеток в процессе иммобилизации.Рисунок 9 – Средняя скорость накопления биомассы свободных клеток C.
vulgaris,мг сух. в-в/л/сут, в сточной воде №2 (см. п. 2.2.1) при концентрациях ПВС в растворе,используемом для получения иммобилизованного препарата на основе клеток C. vulgaris, 5,6, 7, 8 % (концентрация иммобилизованных клеток C. vulgaris в среде 0,4 г сух. в-в/л)Таким образом, было установлено, что при внесении в сточную воду №2иммобилизованных клеток C. vulgaris в концентрации 0,4 г сух. в-в/л максимальная средняяскорость накопления их биомассы QC=200±9 мг сух. в-в/л/сут соответствует образцу сисходной концентрацией раствора ПВС - 7%.В связи с вышесказанным в дальнейших исследованиях для иммобилизации клетокC.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
