Получение и применение биологически доступных соединений железа, стабилизированных гуминовыми веществами (1105651), страница 22
Текст из файла (страница 22)
При его почвенном использовании содержание железав тканях огурцов составило 1435% от контроля, или 1351 мг/кг в абсолютномзначении. Следует отметить, что при проведении экспериментов в водныхкультурах аналогичный показатель для хелата составлял всего 504 мг/кг, т.е. почтив 3 раза ниже. Кроме того, данный уровень заметно превышает физиологическинормальный уровень содержание железа в растениях огурца, составляющий около70 мг/кг. Наблюдаемое избыточное поглощение железа может быть вызванонедостатком других микроэлементов, таких как фосфор, калий и цинк в питаниирастений, наблюдается избыточное поглощение железа с превышением содержанияжелеза до трех раз. Также одним из возможных объяснений высокого содержанияжелеза в растениях, обработанных хелатом Fe-ЭДДГА, может быть усиление129фитоэкстракции железа из почвы.
Согласно механизму, предложенному в работах[209], [210], [211] под воздействием синтетических хелатирующих агентов, такихкак ЭДТА, ЭДГГА и других происходит переход в биологически доступную формусодержащихся в почве металлов. Препарат Fe-ЭДДГА, как и большая частьаналогичных комплексонов является нестехиометрическими хелатами [118], вкоторых часть металлсвязывающих центров (карбоксильных и аминогрупп)свободна или занята ионами натрия, в связи с чем он может оказывать действиесходное с исходным комплексоном ЭДДГА.Усиление фитоэкстракции металлов из почв может быть эффективноиспользовано при рекультивации территорий, загрязненных тяжелыми металлами,однако может быть опасным при выращивании растений, предназначенных дляупотребления в пищу, так как перевод в биологически доступную форму ипоследующим накоплением в растениях происходит также и для токсичныхметаллов. С другой стороны, избыточное поглощение железа в условиях дефицитапо другим микроэлементам может быть использовано для создания отмеченопищи, искусственно обогащенной данным микроэлементом, как предложено вработе [112].В отличие от Fe-ЭДДГА, усиленного поглощения железа растениямиогурцов в присутствии Fe-CHS-05 установлено не было.
Однако проведенныеэксперименты с почвенной культурой указывают на значительное снижениебиодоступности железа в условиях выбранных почв. Так, в условиях гидропоникив присутствии этого гумата концентрация железа в тканях огурца составляла243 мг/кг, а при внесении в почву эта величина составила 143 мг/кг, что составило364 и 152% соответственно.
Также необходимо отметить, что содержание железа врастениях контрольной группы (94 мкг/г) в условиях почвенной культуры вышетакового для растений огурца контрольной группы водной культуры (67 мкг/г), чтосвидетельствует о том, что дефицит желез у растений, выращиваемых на данныхпочвах, не так выражен, как при вегетации на водной культуре.
Наблюдаемаянизкая эффективность железосодержащих препаратов обусловлена ещё и тем, чтоиспользованные нами почвы являются также дефицитными по еще одному илиболее микроэлементов.130Таким образом, проведенные эксперименты в условиях железодефицитногохлороза на почве показали незначительную эффективность как синтезированногогумата железа, так и коммерческого хелата железа, что обусловлено, по-видимому,недостатком других микроэлементов в доступной для растений форме в даннойпочве.Тем не менее, сравнительная оценка функционального состоянияконтрольныхуказываетинаобработанныхжелезосодержащиминеобходимостьпродолженияпрепаратамидальнейшихрастенийисследований,направленных на получение, характеристику и оценку эффективности органонеорганическихсоединенийнаосновеГВикомплексанеобходимыхмикроэлементов.3.3.4 Исследование цитотоксичности соединений Fe - ГВ3.3.4.1 Оценка цитотоксичности соединений железа, стабилизированныхгуминовыми веществами с использованием МТТ-тестаДля выявления цитотоксичности веществ в последнее время все ширеприменяютразличныеметоды,основанныенаокрашиванииклетокопределенными красителями, с последующей экстракцией красителя из клетокорганическим растворителем и дальнейшим определением его концентрации спомощью спектрофотометрических методов.
На этом принципе основан, такназываемый,МТТ-тест,ставшийвнастоящеевремястандартнымвцитотоксических исследованиях и позволяющий с большой точностью и вкороткие сроки определять количество жизнеспособных клеток [212].МТТ-тест основан на способности митохондриальных дегидрогеназ (вчастности, сукцинатдегидрогеназы) восстанавливать водорастворимый 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиумбромид(МТТ)доводонерастворимого темноокрашенного формазана, который кристаллизуетсявнутри клетки.
Далее формазан может быть элюирован из клеток с помощьюорганических растворителей. Перевод формазана в растворенное состояние можетбыть осуществлен с помощью органических растворителей (изопропанол, ДМСО,ДМФА). Так как только клетки с живыми митохондриями могут осуществлятьреакциювосстановленияМТТ доформазана,тоинтенсивность окраскиполучаемого элюата прямо связана со степенью неповрежденности митохондрий.131Установлено, что оптическая плотность элюатов при длине волны 570 нм(максимум поглощения формазана) пропорциональна количеству жизнеспособныхклеток в образце. Таким образом, данный метод позволяет по оптическойплотности солюбилизированного красителя в элюате оценивать количествожизнеспособных клеток в исследуемом образце. Вывод о цитотоксичностиисследуемого вещества делают на основании сопоставления изменения оптическойплотности элюата из обработанных исследуемым веществом клеток по отношениюк элюату из контрольных клеток [213].
МТТ-тест технически прост, чувствителен ивоспроизводим, однако для решения каждой конкретной экспериментальной иликлинико-диагностической задачи в ряде случаев требуется его оптимизация.В нашей работе для оценки цитотоксичности органо-неорганическихсоединений железа с ГВ использовали клон-пролиферирующие эпителиальныеклетки карциномы гортани человека линии HEp-2. Выбор этого типа клеток былобусловлен тем, что они характеризуются большим размером ядра, чтообеспечивает возможность легкой визуализации клеточной морфологии иповышает оценочные параметры [214].Исследование цитотоксичности проводили для трех препаратов органонеорганических соединений железа с ГВ:– Fe-CHS-05 как наиболее биологически активное органо-неорганическоесоединение ГВ с железом в виде «зеленой ржавчины»;– Humiron как коммерчески доступное органо-неорганическое соединениеГВ с железом в виде гидроксидов железа (III);– δ FeOOH в ГВ (1000) как органо-неорганическое соединение ГВ с железомв виде ферроксигита.В качестве дополнительных контрольных вариантов в схему экспериментавводили также исходный препарат ГК и ферроксигит δ FeООН.Культуры клеток линии HEp-2 высевали в лунки 96-и луночного планшета ичерез 3 ч вносили исследуемые органо-неорганические соединения.
В качествеконтроля использовали клетки, культивируемые в среде ДМЕМ/F12, содержащей0,5% FBS. Затем клетки инкубировали в течение 24 и 72 ч, и по окончанииинкубирования проводили МТТ-тест. Развитие окраски регистрировали путем132измерения оптической плотности при длине волны 540 нм в лунках 96 луночногопланшета с помощью фотометра 680 BIO-RAD (США).Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунке (Рис. 36).Оптическая плотность, % от контроля14024 ч72 ч120100806040200CHA-Powδ FeOOHFe-Sh-10-05Humironδ FeOOH вГВ (1000)Рис.
36 Влияние ГК, δ FeOOH и соединений Fe-ГВ на оптическую плотностьэлюатов в МТТ-тесте.Как видно из полученных данных, через 24 ч инкубирования ни одно изисследованных органо-неорганических соединений не влияло на жизнеспособностьэпителиальных клеток, что свидетельствует об отсутствии цитотоксичности.Оптическая плотность элюатов при обработке клеток варьировалась в диапазоне(8911)% – (985)% от контроля и значимо не отличалась от него. При увеличениипериода инкубирования до 72 ч было отмечено, что внесение Fe-CHS-10-05 иHumiron приводило к значимому снижению оптической плотности элюата до(668)% и (699)% от контроля соответственно, что указывает на снижениежизнеспособности клеток в присутствии этих соединений. Для препарата δ FeOOHв ГВ (1000) по результатам МТТ-теста цитотоксичность была выражена несколькониже: оптическая плотность в присутствии этого препарата составила 8210% отконтроля.
Влияния ГК и гидроксида железа δ FeООН на жизнеспособность клетокчерез 72 ч после инкубации отмечено не было.133Полученные результаты могут указывать на увеличение биодоступностижелеза в составе органо-неорганических соединениях железа в ГВ. Можнопредположить, что повышение концентрации железа в эпителиальных клеткахсопровождаетсяингибированиемсукцинатдегидрогеназы,ответственнойзавосстановление МТТ до формазана. В настоящее время хорошо известно, чтожелезо, особенно железо (II), является индуктором перекисного окисления липидов(ПОЛ) за счет участия железа в активации и регуляции свободнорадикальныхпроцессоввбиологическихсистемах,причемдляинициацииреакцийсвободнорадикального окисления необходимо присутствие как кислородныхрадикалов, так и ионов железа [215].
Непосредственным цитотоксическимэффектом обладают ионы Fe2+, которые могут вызывать образование свободныхрадикалов по одной из следующих реакций [215]:Fe2+ + O2 Fe3+ O2–Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH–Fe2+ + ROOH Fe3+ + OH– + ROОднакоизбыточнаяконцентрацияFe3+такжеможетвлиятьнасвободнорадикальные процессы, происходящие в клетке. В частности, одним изпереносчиков железа в клетке наряду с апотрансферрином является лактоферрин(ЛФ) – белок с молекулярной массой 78 кДа, связывающий два иона Fe3+.
В связи стем, что в составе комплекса железа с ЛФ способно к переходу Fe3+/Fe2+, тоособенностью лактоферрина является его участие в качестве катализатора вобразовании такой активной формы кислорода (АФК) как гидроксильной радикал[215]:H2O2 + ЛФ-Fe2+ OH– + HO ЛФ-Fe3+Механизм этого процесса аналогичен реакции Фентона. Однако процесс,катализируемый ЛФ, характеризуется 5000-кратным увеличением константыскорости продукции HO.Такимобразом,увеличениесодержанияжелезавклеткахможетсопровождаться усиленной продукцией АФК. АФК, в свою очередь, являютсявыраженнымиингибиторамисукцинатдегидрогеназы[216].Следовательно,наблюдаемый эффект снижения жизнеспособности эпителиальных клеток в134присутствии органо-неорганических соединений железа и ГВ может бытьобусловлен биодоступностью железа в составе этих соединений.
Однакоокончательнаяпроверкавысказаннойгипотезытребуютпроведениядополнительных экспериментов, направленных, с одной стороны, на изучениеконцентрационной зависимости наблюдаемого цитотоксического эффекта, а, сдругой – на выявление его механизма.Особое внимание следует обратить на обнаруженную стимулирующуюактивность ГВ и δ FeOOH по отношению к клеткам эпителия. Оптическаяплотность в присутствии ГК и δ FeOOH через 24 ч инкубирования составила(1274)% и (1214)% от контроля соответственно, что указывает на выраженнуюстимулирующую активность этих препаратов в данных условиях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
