Получение и применение биологически доступных соединений железа, стабилизированных гуминовыми веществами (1105651), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Можнопредположить, что ГК и δ FeOOH либо способствуют выживаемости клеток припроведении эксперимента, либо способствуют их усиленной пролиферации. Чтобыоценить влияние исследуемых препаратов на пролиферацию клеток, нами былорассчитано увеличение количества жизнеспособных клеток в течение опыта. Таккак оптическая плотность элюата соответствует количеству жизнеспособныхклеток в образце, то увеличение количества клеток за 48 ч рассчитывали наосновании отношения оптических плотностей элюатов через 24 и 72 ч (Таблица31).Таблица 31 Увеличение количества эпителиальных клеток в присутствии ГК,δ FeOOH и соединений Fe-ГВ за 48 ч по результатам МТТ-тестаВариантКонтрольH-CHSδ FeOOHFe-CHS-05Humironδ FeOOH в ГВ (1000)σ – стандартное отклонениеУвеличение количества клеток, разы2,31,921,891,71,72,2Σ0,10,060,070,10,20,2Данные таблицы (Таблица 31) показывают, что внесение как препарата ГК,так и δ FeOOH не приводило к усилению пролиферации клеток, а, наоборот,снижало скорость роста клеток. Следовательно, можно высказать предположение,что установленная стимулирующая активность ГК и δ FeOOH обусловлена ихположительным влиянием на выживаемости клеток.135Данные, представленные в Таблице 31, могут служить косвеннымподтверждением высказанного нами ранее предположения о биодоступностижелеза в исследуемых органо-неорганических соединений железа с ГВ: внесениеэтих препаратов приводило к снижению скорости роста эпителиальных клеток.Исключение составил препарат δ FeOOH в ГВ (1000), который не влиял значимо наскорость роста клеток.Таким образом, проведенные эксперименты показали, что внесениеисследуемых органо-неорганических соединений железа приводит к снижениюоптической плотности элюатов, обусловленной, по-видимому, биологическойдоступностью железа в составе этих соединений.
Показано, что наблюдаемыйэффект приводит к снижению скорости роста эпителиальных клеток. Однако,наряду с этим можно ожидать также и уменьшения количества жизнеспособныхклеток в популяции в присутствии исследуемых соединений. Для проверки этогопредположения далее нами были проведены эксперименты, направленные наоценку относительного содержания живых клеток методом прижизненногоокрашивания.3.3.4.2 Оценка цитотоксичности соединений Fe-ГВ методом прижизненногоокрашиванияДля оценки количества живых клеток в популяции в настоящее времяприменяют различные методы, основанные на использовании флюорохромов –специфических красителей, связывающихся с различными компонентами клеток(целевыми биомолекулами). Одним из наиболее широко используемых маркеровжизнеспособности,определяемыхспомощьюфлюорохромов,являетсямембранная целостность [217], [218], [205], [219].
Для определения мембраннойцелостностивыборочноиспользуетсятолькочерезсвойствонекоторыхповрежденныефлюорохромовмембраныклеток,проникатьокрашиваявнутриклеточные структуры в соответствующий цвет. Так, проникновение рядануклеоидных красителей, таких как йодид пропидия или бромид этидия, внутрьклетки происходит только при поврежденной клеточной мембране, при этомсвязанные с ними нуклеиновые кислоты дают эмиссию флюоресценции красногоцвета. Это свойство используется для выявления жизнеспособных клеток вгетерогенных популяциях, для чего применяется дополнительная окраска136красителями типа Syto. На этой основе работает LIVE/DEAD (живой/мертвый)краситель BacLight, представляющий собой смесь красок, с помощью которыхможно отличать жизнеспособные клетки от мертвых [220].
Краситель содержит дваокрашивающих нуклеоид компонента. Зеленый низкомолекулярный флюорохром(Syto 9) может проникать как в живые клетки с неповрежденной плазмалеммой, таки в мертвые клетки с нарушенными плазматическими мембранами. Послепоступления Syto 9 в клетки он связывается с нуклеиновыми кислотами собразованием зеленого флуоресцирующего комплекса. Высокомолекулярныйкрасный флюорохром йодид пропидия, в свою очередь, проникает только черезповрежденныемембраны.Послепоступленияонтакжесвязываетсяснуклеиновыми кислотами, что приводит к снижению флуоресценции в зеленой,обусловленной комплексами Syto 9 с нуклеиновыми кислотами, и появлениюфлуоресценции в красной области, вызываемой комплексами йодид пропидия.Такимобразом,клетки, проинкубированныевприсутствииэтихкрасокодновременно, будут флюоресцировать зеленым (жизнеспособные) или красным(мертвые) в зависимости от их жизнеспособности [221].
Далее можно провестиподсчет живых и мертвых клеток с использованием флуоресцентного микроскопа.Внашейработеоценкужизнеспособностиклетокпроводилисиспользованием метода флуоресцентного окрашивания клеток набором L-7007(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, Invitrogen). Культивированиеэпителиальных клеток линии HEp-2 проводили на поверхности или в объемеисследуемых материалов.
После 24 ч и 72 ч культивирования учитываликоличество живых и мертвых клеток с использованием флуоресцентногомикроскопа Axiovert 200, возбуждение флуоресценции проводили при Ex = 470 нм.Наряду с учетом количества жизнеспособных клеток оценивали также морфологиюклеток, их способность к адгезии и распластыванию. Характерный вид клеток,культивируемых в среде с добавлением препаратов железа, представлен намикрофотографиях на рисунках (Рис.
37, Рис. 38).137КонтрольГКδ FeOOHРис. 37 Внешний вид эпителиальных клеток линии НЕр-2, культивируемых вконтроле, среде с добавлением ГК и δ FeOOH. Флуоресцентное окрашивание SYTO 9(слева) и иодидом пропидия (справа). Увеличение 200х. Линейка 100 мкм.138Fe-CHS-05Humironδ FeOOH в ГВ (1000)Рис. 38 Внешний вид эпителиальных клеток линии НЕр-2, культивируемых в средес добавлением Fe-CHS-05, Humiron и ГК и δ FeOOH в ГВ (1000).
Флуоресцентноеокрашивание SYTO 9 (слева) и иодидом пропидия (справа). Увеличение 200х. Линейка100 мкм.Результаты исследований показали, что внешний вид клеточного монослоя,степеньраспластыванияижизнеспособностьклеток,культивируемыхвприсутствии исследуемых материалов, не отличался от такового в контроле. Такимобразом, исследуемые образцы в данных концентрациях не влияли негативноотносительное содержание живых клеток в популяции, адгезию и распластываниеактивность эпителиальных клеток в течение 24 ч.139Выводы1.Разработаны способы получения биологически доступных соединенийжелеза, стабилизированных гуминовыми веществами (ГВ), для использованиявместо небезопасных для окружающей среды хелатов железа.2.Установлено,чтоГВмогутбытьиспользованывкачествестабилизирующих агентов при получении высокодисперсных форм оксидныхсоединений железа.3.Установлено, что применение препаратов Fe-ГВ позволяет эффективноустранить дефицит железа, содержание железа в листьях возрастает до 360%от контроля, а хлорофилла - до 400% от контроля.4.Установлено, что полученные препараты Fe-ГВ образуют устойчивыесуспензии в водных растворах при концентрации фонового электролита более150 ммоль/л, что подтверждает возможность их практического применения ввиде коллоидных растворов.5.Установлено, что препараты Fe-ГВ не обладают цитотоксичностью поотношению к клеточной линии HEp-2 (выживаемость клеток составляет 90%),что подтверждает их безопасность для окружающей среды.140141Список сокращенийАК – аскорбиновая кислотаАПТС – 3-аминопропилтриметоксисиланАФК – активные формы кислородаГВ – гуминовые веществаГСО – государственный стандартный образецДМФА – N,N – диметилформамидДСР – динамическое светорассеяниеИК – инфракрасная (спектроскопия)МЖ – магнитные жидкостиМГО – Международное Гуминовое Общество (IHSS)МНК – метод наименьших квадратовПЭМ – просвечивающая электронная микроскопияРФА – рентгенофазовый анализРОВ – растворенное органическое веществоТНЗ – точка нулевого зарядаФК – фульвокислотыЭТЦ – электронтранспортная цепьЯГР – ядерный гамма-резонанс (эффект Мессбауэра)Fe-ЭДДГА – этилендиамин-N,N’-ди (2-гидроксифенилацетат) железаДТПА – диэтилентриамин-N,N,N’,N”,N”-пентаацетат железаFe-ЭДТА – этилендиамин-N,N,N’,N’-тетраацетат железаFe-ЭДДГМА – этилендиамин-N,N’-ди (2-гидрокси-4-метилфенилацетат)железаFe-ЭДДГСА – этилендиамин-ди (2-гидрокси-5-сульфофенилацетат) железаFe-ЭДДОА – этилендиаминдиоксифенилацетат железаMQ – дистиллированная вода высокой степени очистки, полученная спомощью систем Milliporeмасс.
– массовые (проценты)142Список использованной литературы1.Орлов Д.С. Химия почв. — Москва : Изд-во МГУ, 1992. — 259 с.2.Thurman E.M. Organic geochemistry of natural waters. — Dordrecht, TheNetherlands : Kluwer Academic Publishers, 1985. — P. 497-503.3.Stevenson F.J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions.
— NewYork : John Wiley&Sons, 1982. — p. 443.4.Kleinhempel D. Ein Beitrag zur Theorie des Huminstoffzustandes. //Albrecht-Thaer-Archiv. 1970. V. 14. № 3.5.Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. —Москва : Изд-во МГУ, 1990. — 325 с.6.Ziechmann W. Huminstoffe – Probleme, Methoden, Ergebnisse. —Weinheim – Deerfield Beach/Florida – Basel : Verlag Chemie, 1980. — 408s.7.Bollag J.-M., Mayers K.
Detoxification of aquatic and terrestrial sitesthrough binding of pollutants to humic substances // Sci. Total Environ.1992. V. 117/118.8.Stevenson F.J. Geochemistry of soil humic substances // In HumicSabstances in Soil, Sediment, and Water: Geochemistry, Isolation, andCharacterization Aiken G.R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P.— New York : John Wiley & Sons, 1985.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
