диссертация (1105558), страница 5

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Главным недостатком ФИТЦ является необходимость удаления избытка реагента перед хроматографическим разделением. В противном случае он постепенно разрушает материал неподвижной фазы хроматографической колонки [⁵⁴]. Поскольку температура кипения ФИТЦ достаточно высока, для его удаления из смеси под вакуумом требуется около часа. В качестве более удобной альтернативы предложены бутилизотиоцианат, который полностью удаляется из смеси за 10 минут [⁵⁵], и бензилизотиоцианат [⁵⁶], чьи производные гораздо более стабильны, чем ФИТЦ-аминокислоты. Детектирование осуществляется при 240 и 246 нм соответственно. Чувствительность определения аминокислот составляет 1-10 пмоль. Для 4-(Диметламино)азобензол-4’-изотиоцианата предложен другой вариант удаления избытка непрореагировавшего агента: смесь гептана и этилацетата. Наличие диазо-группы позволяет детектировать производные более селективно в видимой области при 436 нм [М].

Альдегиды

Для флуориметрического определения гидразинов, в основном, используют различные ароматические альдегиды, поскольку образующиеся гидразоны обладают большими квантовыми выходами флуоресценции.

Определять гидразин было предложено в виде производного с 5-хлорсалициловым альдегидом [⁵⁷]. Образующийся диазин флуоресцирует при длинах волн возбуждения и испускания 400 нм и 570 нм соответственно. Реакцию проводили в водно-спиртовой среде с добавкой уксусной кислоты (30:66:4), так как реагент плохо растворим в воде. Оптимальное время реакции составило 10 минут при комнатной температуре. В выбранных условиях линейность сохраняется в диапазоне 0.2–9.3 мкМ, предел обнаружения составил 0.08 мкМ. Было показано, что данный подход позволяет определять гидразин с хорошей селективностью в присутствии других соединений, содержащих аминогруппу. Таким образом, предложенный метод обладает рядом существенных преимуществ, таких как высокие чувствительность и селективность определения гидразина, коммерческая доступность 5-хлорсалицилового альдегида, устранение влияния фона за счет того, что производное флуоресцирует в длинноволновой области.

Флуориметрическое определение НДМГ в виде гидразонов коричного альдегида, о, п, м-нитробензальдегидов описано в работе [⁵⁸]. Максимальная скорость реакции в случае всех четырех альдегидов достигается при проведении реакции при 80°С и добавлении в реакционную смесь уксусной кислоты и этиленгликоля (80%). Измерения флуоресценции проводили при длинах волн возбуждения и эмиссии 360 и 530 нм соответственно для коричного альдегида, 350 и 430 нм для нитробензальдегидов. Коричный альдегид позволяет проводить определение НДМГ более экспрессно (10 минут), так как образующийся диметилгидразон содержит систему сопряжения бензольного кольца, двойной углерод–углеродной связи и двойной связи углерод–азот, которая обеспечивает устойчивость продукта и тем самым облегчает легкость его образования. К тому же диметилгидразон коричного альдегида обладает высоким значением квантового выхода флуоресценции, за счет чего достигается и большая чувствительность его определения. Диапазон линейности определения НДМГ с коричным альдегидом составил 0.001–0.01 мг/л.

Пример использования п-ДМАБ для флуориметрического определения гидразина в плазме крови приведен в работе [⁵⁹]. Реакцию проводили в среде трихлоруксусной кислоты при 70°С в течение 45 минут. Экстракцию полученного продукта осуществляли 3 мл хлороформа. Дальше полученный экстракт высушивали над безводным сульфатом магния и измеряли флуоресценцию гидразона при длинах волн возбуждения и регистрации флуоресценции 466 и 546 нм соответственно. Было установлено, что добавка трихлоруксусной кислоты способствует осаждению белков и увеличивает интенсивность флуоресценции за счет образования ионной пары с образующимся диметиламинобензалазином. Предел обнаружения гидразина составил 10 мкг/л.

о-Фталевый альдегид взаимодействует только с первичными аминогруппами в щелочной среде с образованием изоиндолов. Для протекания реакции с аминосоединениями небходимо присутствие нуклеофильного регнета, например, 2-меркаптоэтанола. Реакция протекает около 2 мин при кмнатной температуре в боратном буферном растворе с рН 6-8 для аминов и рН 9.7-10.0 в случае аминокислот, с добавлением метанола. 360/455 нм.

Реакция с ОФА может быть реализована в варианте послеколоночной дериватизации, т.к. сам диальдегид не флуоресцирует. Воспроизводимость не высока, поскольку продукты дериватизации не очень стабильны. Более стабильные производные образуются с такими нуклеофильными реагентами как 2-этантиол, 3-меркаптопропионовая кислота и N-ацетил-L-цистеин [М]. Добавка нитрилоуксусной кислоты повышает стабильность производных в 4 раза [⁶⁰]. Экстракция хлороформом или этилацетатом позволяет удалить избыток реагента. Пределы обнаружения аминокислот составляют около 1 пмоль.

Подобные ОФА реагенты, такие как 2,3-нафталиндиальдегид (НДА), антрацендиальдегид (АДА) и т.п., реагируют с аминами в присутствии других нуклеофилов (цианиды калия и натрия). Реакции протекают в течение 15-60 мин при комнатной температуре, а продукты более стабильны по сравнению с ОФА-производными, что позволяет использовать аналогичные реагенты для предколоночной дериватизации. НДА демонстрирует более высокую чувствительность определениея аминокислот (10-50 фмоль).

В работе [⁶¹] Даниельсон и Конрой предложили определять гидразин и аммиак в виде флуоресцирующих производных с о-фталевым альдегидом. Реакция дериватизации в присутствии меркаптоэтанола приводит к замыканию цикла и образованию 1-(2-гидроксиэтил)тиоизоиндола. Длина волны возбуждения флуоресценции совпадает для обоих производных и составляет 340 нм, в то время как длина волны регистрации флуоресценции для аммиака составляет 465 нм, а для гидразина – 495 нм. Максимальная интенсивность флуоресценции производного аммиака достигается в щелочных средах при рН 9–10, для гидразина — 4–5. Отсутствие флуоресценции гидразина при проведении реакции в щелочной среде объясняется образованием в этих условиях фталазина, являющегося нефлуорофором. Таким образом, различие в оптимальных значениях рН позволяет проводить определение гидразина и аммиака без предварительного разделения. Предел обнаружения гидразина данным методом составил 0.1 мг/л.

В работах [⁶², ⁶³] для определения гидразина, ММГ и НДМГ методом спектрофлуориметрии в качестве дериватизующих реагентов изучены несколько альдегидов ароматического ряда: ОФА, 2,3-нафталиндиальдегид (НДА) и 2,3-антрацендиальдегид (АДА). Ранее было известно использование НДА для определения аминов. НДА реагирует с первичной аминогруппой в присутствии нуклеофилов, таких как меркаптоэтанол, 2-меркаптопропионовая кислота или цианид-ион, с образованием стабильных во времени замещенных изоиндолов, обладающих высоким квантовым выходом флуоресценции [⁶⁴].

Установлено, что взаимодействие гидразинов с диальдегидами радикально отличается от поведения аминов в данной реакции. Как видно из рис. 6, на котором представлена схема реакции гидразина с НДА, в ходе реакции образуется 2,3-диазоантрацен (4). Установлено, что добавление в систему нуклеофила не оказывает никакого влияния на протекание дериватизации.

Рис. 6. Схема реакции НДА с гидразином.

Реакция НДА с гидразином заканчивается за 10 минут при рН 2.5 и приводит к образованию продукта, обладающего наибольшим квантовым выходом флуоресценции по сравнению с двумя другими альдегидами, что позволяет добиться значительного снижения предела обнаружения. При этом продукт реакции флуоресцирует только в кислой среде, что свидетельствует о том, что флуорофором является кислотный коньюгат 2,3-диазоантрацена (5, рис. 6.). В аналогичных условиях образуется и продукт реакции гидразина с ОФА. В это же время оптимальное значение рН для реакции гидразина с АДА составляет 11, а оптимальное время реакции — 10 с.

Влияние рН на реакцию с диальдегидами обусловлено балансом двух факторов: протонированием гидразина, что вызывает уменьшение концентрации нейтральной формы, вступающей в реакцию, и кислотным катализом. При значении рН < 5 более 99% гидразина в растворе находится в протонированной форме N₂H₅⁺. Протонирование азота кардинально меняет скорость реакции (образование соединений 2–3, рис. 6). Для гидразина pK_a = 7.9, а, значит, скорость образования нейтрального комплекса, 2,3-диазоантрацена (4, рис. 6) будет значительно больше при рН > 8. Оптимальное значение рН выбирается таким, чтобы обеспечить концентрацию протонов, достаточную для катализа реакции конденсации, но малую для протонирования основной части гидразина. Поэтому было предложено по аналогии с АДА проводить реакцию гидразина с НДА в щелочной среде при рН 8 в течение 2 минут с последующим быстрым подкислением до рН 2.4, чтобы перевести производное во флуоресцирующую форму 5.

Замещение водорода на метильные группы в гидразине приводит к значительным изменениям механизма реакции. В результате взаимодействия ММГ с НДА в нейтральной или щелочной среде образуется положительно заряженный флуоресцирующий комплекс (3, рис. 7). На второй стадии конденсации из-за отсутствия доступного атома водорода (замещенного на метильную группу) заряд локализуется на всей молекуле. Установлено, что флуоресценция производного ММГ может наблюдаться только в щелочной области (рН > 7) в отличие от реакции с гидразином.

На рис. 8 представлена схема реакции НДМГ с НДА. Как видно, первая стадия конденсации аналогична реакции с ММГ, но из-за наличия двух метильных групп у атома азота невозможно отщепление второй молекулы воды и замыкание ароматического цикла, что влечет за собой снижение чувствительности определения НДМГ (табл. 2.) Наблюдаемый при 500 нм сигнал, возможно, связан с наличием очень малого квантового выхода флуоресценции продукта 3 или с образованием другого побочного продукта реакции.

Рис. 7. Схема реакции НДА с ММГ.

Рис. 8. Схема реакции НДА с НДМГ.

Гидразоны, образующиеся в результате реакции ММГ и НДМГ с АДА, не обладают флуоресценцией. Сводные данные по изученным подходам определения гидразина, метилгидразина и НДМГ представлены в табл. 1.

Таблица 2. Определение гидразина, ММГ и НДМГ в виде производных с ароматическими диальдегидами методом спектрофлуориметрии

Подход, основанный на использовании НДА, является одним из самых чувствительных методов определения гидразина в водных растворах.

Характеристики

Список файлов диссертации