диссертация (1105558), страница 4
Текст из файла (страница 4)
5-Диметиламино-нафталинсульфохлорид (дансил хлорид) взаимодействует со вторичными и первичными аминосоединениями в слабощелочной среде, оптимальное время реакции сильно зависит от типа анализируемого вещества (30-120 мин). Дансильные производные достаточно стабильны и характеризуются большим Стоксовым сдвигом. Реагент гидролизуется в процессе дериватизации с образованием интенсивно флуоресцирующей 1-диметиламинонафталин-5-сульфокислоты. Поэтому дансилирование используется, в основном, для предколоночной дериватизации. Чувствительность метода сопоставима с дериватизацией о-фталевым альдегидом. Для повышения чувствительности детектирования дансилированных аминокислот можно использовать бычий сывороточный альбумин, вводя его в систему после разделяющей колонки [28]. Дансил хлорид также способен взаимодействовать с другими функциональными группами, например, с фенольными.
Широкое распространение получило использование дансилхлорида в качестве модифицирующего реагента для определения аминов, аминокислот и пептидов [29, 30]. С помощью реакций дансилирования аминокислоты определяют в напитках, пищевых продуктах, биологически активных добавках. Дансилированные первичные и вторичные амины практически всегда детектируются флуориметрически [31,32], УФ-детектирование осуществляется лишь в редких случаях. Флуоресценция дансильных производных аминокислот гасится в водных растворах, квантовый выход флуоресценции в десять раз меньше, чем в органических растворителях.
Образование дансильных производных аминокислот идёт по следующей схеме:
Дансилхлорид взаимодействует с непротонированной аминогруппой в щелочной среде только при рН > 9 [33], так как при более низком рН аминогруппа находится в неактивном состоянии в виде -NH3+ [34]. Однако с повышением щёлочности среды растёт вероятность протекания конкурирующей образованию производных реакции – гидролиза органического реагента. На рис.5 представлена зависимость констант скоростей основной реакции и конкурентной реакции гидролиза дансилхлорида от рН реакционной смеси.
При рН>9.5 константа скорости реакции гидролиза резко возрастает, и гидролиз протекает очень интенсивно, что приводит к деструкции дансилхлорида уже при рН 10. Таким образом, чтобы максимально уменьшить гидролиз дансилхлорида реакцию следует проводить при рН 9.5-9.6.
Гидразин, ММГ и НДМГ проявляют сходство с аминокислотами в реакции дансилирования:
Авторы работы [35] предложили проводить дериватизацию НДМГ в щелочной среде с последующей экстракцией из воды диэтиловым эфиром, однако не привели подробного описания условий проведения реакции.
Для селективного определения гидразинов в реальных объектах важно подобрать условия хроматографического разделения их дансильных производных. В литературе этой теме посвящена только одна работа [11л], в которой хроматографическое разделение дансильного производного 1,1-диметилгидразина проводили на колонке Brownlee Labs RP18 (220×2.1 мм, 5 мкм) в режиме градиентного элюирования (ацетонитрил – фосфатный буферный раствор при рН 8.0) с последующим флуоресцентным детектированием при λвозб.= 360 нм и λисп.=470 нм.
В основном, описано разделение производных аминокислот. Определение дансильных производных аминокислот проводят при элюировании подвижной фазой, содержащей ацетонитрил и фосфатный буферный раствор с рН, обеспечивающим максимальную селективность разделения производных аминокислот. Авторы работы [22л] использовали подвижную фазу состава ацетонитрил – 0.01 М фосфатный буфер с рН 7 (39:61). Естественно, что выбор условий разделения определялся свойствами сорбента и размером колонки.
В работе [36] проводили разделение дансильных производных аминокислот на колонках с силикагелем, модифицированным октильными группами. Скорость элюирования 2 мл/мин. Для изократического элюирования использовали смесь метанола и воды (42:58) с добавлением ледяной уксусной кислоты и триэтиламина. Оптимальное значение рН среды в которой идёт разделение – 7, было использовано и в большинстве работ.
Авторы работы [37] проводили разделение на колонке “LiChrosorb RP 8” при температуре 45°С, со скоростью элюирования 1.5 мл/мин. Состав подвижной фазы 0.01 М Na2HPO4 – метанол (50:50), к которой каждую минуту добавляли 1.5 мл метанола. Авторам удалось разделить восемнадцать аминокислот. Также в этой работе описано определение дансильных производных аминокислот нормально-фазовой хроматографией.
Авторами [38] был разработан быстрый способ определения пентаазапентакозана (ПАПК) пентагидрохлорида, противоракового агента. Дансилирование проводили в буферном растворе с триэтиламином (рН 11). С помощью добавок ацетонитрила и воды достигали 60%-ного содержания органического растворителя в пробе. Реакцию проводили в темноте в течение 4, 8 и 24 ч, останавливали добавлением аликвоты 2 мл реакционной смеси к 2 мл растора глицина (2 мг/мл). Через 10 мин в нейтрализованные растворы добавляли 0.04М уксусную кислоту с рН 5. Разделение проводили на колонке RP-C8 с подвижной фазой 40 мМ CH3COOH/NH4OH (pH 5)-CH3CN (10:90) и УФ-детектированием при 254 нм. Предел обнаружения составил 0.7 пмоль.
Для дансилхлорида характерно протекание побочных реакций гидролиза и образования дансиламида в условиях большого избытка реагента:
R-NH2 + DnsCl → R-NH-Dns + HCl
DnsCl+ H2О → DnsOH + HCl
R-NH-Dns + DnsCl → DnsNH2 + другие продукты.
Связать избыток дансилхлоида и устранить возможноть протекания побочных реакций можно введением в систему первичного амина (метиламина или этиламина) через 35 мин после смешения реагентов [30м].
Дансил хлорид нестабилен в диметилсульфоксиде, который не следует использовать в качестве растворителя для приготовления раствора реагента. Максимум поглощения дансильных производных наблюдается между 310 и 350 нм. Пики обычно широкие, поэтому подход не слишком чувствительный. Существенным недостатком метода является длительность получения дансильных производных. Ускорение реакции дериватизации позволило бы сократить время анализа, так как образование дансильных производных – лимитирующая стадия.
Авторами работы [29м] было рассмотрено влияние температуры на реакцию дериватизации и показано, что это достаточно сложный фактор. Повышение температуры увеличивает как скорость гидролиза дансилхлорида, так и скорость реакции дериватизации. В большей степени повышение температуры сказывается на скорости гидролиза органического реагента, поэтому целесообразнее проводить реакцию при комнатной температуре. По другим данным, Люнте [30м] получил хорошие, согласующиеся между собой результаты при проведении реакции как при нагревании за короткое время (60°С, 30 минут), так и при более низкой температуре за более длительный период времени (40°С, 60 минут). Понижение температуры резко уменьшает растворимость дансилхлорида [29м]. Таким образом, однозначных выводов пока не сделано и этот вопрос нуждается в дополнительном исследовании.
Использование микроволнового излучения как один из способов интенсификации реакции дансилирования аминокислот был предложен в работе [39], и перспективен для дансилирования замещенных гидразинов.
Карбонил хлориды и фториды
Карбонил хлориды взаимодействуют с первичными, вторичными, третичными аминами и спиртами. Их реакционноспособность считается выше, чем сульфонил хлоридов.
9-Флуоренилметилхлороформиат (9-флуоренилметоксикарбонил хлорид, ФМОК)
используется для предколоночной дериватизации первичных и вторичных аминосоединений [40]. Реакции протекают в боратном буферном растворе с рН 8 в течение 2 мин, производные достаточно устойчивы. Однако, ФМОК и его продукт гидролиза интенсивно флуоресцируют, поэтому их необходимо удалять из реакционной смеси экстракцией органическим растворителем, например, пентаном. Аналогично дансил хлориду, ФМОК реагирует и с фенольными группами. Также он взаимодействует с имидазольным кольцом аминосоединений. Чувствительность реагента сопоставима с результатами ОФА-метода. В работах по определению аминокислот часто используется комбинация этих двух реагентов, что обеспечивает одновременное определение первичных и вторичных аминосоединений в автоматизированном режиме.
Результаты определения ФМОК-аминокислот с УФ-детектором при 265 нм были сопоставимы с таковыми при флуориметрическом детектировании (265/340 нм), кроме триптофана, для которого наблюдалось тушение флуоресценции [41]. ФМОК растворяли в осушенном ацетоне, реакцию проводили в боратном буфере при комнатной температуре в течение 10 мин. Избыток реагента удаляли взаимодействием с 25мМ раствором 1-аминоамантадина в метаноле в течение 2 мин.
Существуют работы, в которых синтезированное производное ФМОК с гидразином используется как реагент для определения сахаридов [42]. Авторы отмечают, что ФМОК-гидразин очень устойчив. Другие работы также подтверждают его устойчивость, например, в [43] проводили дериватизацию с ФМОК-гидразином при 50°С в течение 4 часов для ВЭЖХ-определения малональдегида.
На основе ФМОК синтезирован новый реагент N-(9-флуоренилметоксикарбонилокси)сукцинимидил, который уже не взаимодействует с фенольными и спиртовыми гидроксильными группами и имидазолами, стадии экстракции не требуется [44]. Однако пики реагента и продукта его гидролиза все же присутствуют на хроматограмме.
Сукцинимидилы
В последнее время синтезировано несколько новых органических реагентов обладающих чрезвычайно сильной флуоресценцией. Одним из таких реагентов является 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидил карбамат. АХК количественно реагирует со всеми первичными и вторичными аминокилотами за несколько секунд с образованием стабильных флуоресцирующих производных без побочных продуктов, влияние матрицы при этом незначительно [45]. Производные АХК обладают превосходными флуоресцентными характеристиками при λпогл. = 395 нм, после предварительного возбуждения молекул при λвозб. = 250 нм [46]. Это очень селективный диапазон длин волн, так как различие между численными значениями длин волн возбуждения и испускания больше 100 нм. Сукцинимидный остаток является легко замещаемой группой, а избыток реагента после полной дериватизации аминокислот гидролизуется, но продукт гидролиза не мешает флуоресцентному детектированию. Это позволяет вводить реакционную смесь непосредственно в колонку без предварительной пробоподготовки. 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидил карбамат быстро реагирует с аминокислотами, с цистином и лизином образует дизамещённые продукты, для их превращения в моно-производные реакционную смесь выдерживают при 50 0С 10 минут [47]. Пределы обнаружения аминокислот с УФ-детектированием при 248 нм составили 0.07-0.3 пмоль. Контроль с использованием УФ-детектора при 230 нм показал, что через несколько минут лишь 2% аминокислот остаются свободными и АХК производные аминокислот более стабильные чем о-фталевые аналоги [48].
Сукцинимидонафтил карбамат образует производные с аминокислотами (нафтилкарбамоилы) за 1 мин в 0.5М боратном буферном растворе с рН 9.5 при комнатной температуре Быстрота реакции и удаление избытка реагента гидролизом делают его неплохим реагентом для предколоночной дериватизации [49]. Интенсивность флуоресценции производных высока и позволяет достигать пределов обнаружения на уровне пмоль. λвозб = 305 нм, λрег = 378 нм.
Изоцианаты
Фенилизоцианат реагирует с первичными и вторичными аминами с образованием N,N’-дизамещенных мочевин [50].
1-Нафтилизоцианат также используется для предколоночной дериватизации аминокислот. Реагент растворяли в хорошо осушенном ацетоне и добавляли к смеси аминокислот, избыток изоцианата экстрагировали гексаном [51]. Производные – нафтилкарбамоиламинокислоты – интенсивно флуоресцировали при 305/385 нм и поглощали при 222 нм, что позволяло детектировать цистеин и триптофан, в случае которых флуоресценция затухала. Изоцианаты легко взаимодействют с водой и спиртами с образованием уретанов, поэтому их вытесняют менее реакционноспособные изотиоцианаты.
Изотиоцианаты
Фенилизотиоцианат (ФИТЦ, реагент Эдмана) широко испольуется в анализе аминокислот, пептидов и других аминосоединений [52, 53]. Изотиоцианаты легко взаимодействуют с первичными и вторичными аминогруппами с образованием тиомочевин:
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
