Диссертация (1105151), страница 9
Текст из файла (страница 9)
11: Применение оптического пинцета для измерения механико-электрических свойствэритроцитов. а — измерение вязкости мембраны эритроцитов в агрегате, б —измерение силыагрегации пары эритроцитов, в — зависимость силы действующей на агрегат эритроцитовот скорости передвижения ловушек. [77].Рис. 12: Микро-фотография эритроцитов, образовавших “монетный столбик” [81].Обзор литературы: применение метода оптического пинцета...46агрегации эритроцитов.Агрегация эритроцитов была обнаружена еще в 18 веке [82], однако систематическое исследование механизмов агрегации началось в конце 20-х годов прошлого векас работы [83].
Было замечено, для образования агрегатов эритроцитов необходимо наличие в плазме крупных молекул, в основном, фибриногена [83]. В отсутствие такихмолекул агрегация не происходит. Тем не менее, физические механизмы агрегацииэритроцитов до сих пор точно не установлены. Для ее объяснения используют двеосновные теории. В основу первой, классической “мостиковой” теории [84] положено представление о том, эритроциты способны адсорбировать на своей поверхностикрупномолекулярные белковые структуры. Сближаясь в кровотоке, эритроциты могут одновременно адсорбировать эти крупные структуры, которые становятся своегорода “мостиками”, связывающими эритроциты. Считается, что агрегации эритроцитов в наибольшей мере способствуют молекулы фибриногена, способные к образованию трехкомпонентных агрегатных структур. Полагают, что взаимодействие фибриногена с эритроцитом носит неспецифический характер и осуществляется за счет слабых ван-дер-ваальсовых и водородных связей.
Согласно теории “истощенного слоя”,напротив, считается, что вблизи поверхности эритроцитов крупных белковых молекул меньше, чем в окружающей плазме крови. При сближении эритроцитов в потокемежду ними возникает истощенный слой. Возникающий при этом градиент онкотического давления (доля осмотического давления, создаваемая высокомолекулярнымикомпонентами раствора) приводит к дальнейшему сближению эритроцитов [85].Одним из самых широко используемых в клинической практике методов непрямого измерения агрегационных свойств крови является оценка скорости оседанияэритроцитов (СОЭ). Для этого образец крови помещают в узкую пробирку.
Так каккровь уже не находится в потоке, где одновременно с агрегацией постоянно происходила дезагрегация, вызванная сдвиговыми напряжениями, эритроциты постепенноначинают собираться в более крупные агрегаты, взаимодействуя между собой. Черезнекоторое время фракция плазмы полностью отделяется от эритроцитов, которые вагрегированном состоянии оседают на дно.
По времени оседания судят о скоростиагрегации [86].Метод втягивания мембраны эритроцитов в микропипетку является прямым методом измерения деформационных и агрегационных свойств клеток. Однако такойОбзор литературы: применение метода оптического пинцета...47способ является контактным, что сопряжено с риском неконтролируемых клеточныхизменений.
К примеру, в работе [87] было обнаружено изменение формы эритроцитапосле частичного втягивания его в микропипетку. До эксперимента эритроцит имелформу дискоцита (обычную форму), после — форму эхиноцита (клетка имеет шипыодинаковых размеров, располагающиеся равномерно по поверхности эритроцита).Другим распространенным методом исследования агрегационных свойств эритроцитов является фотометрический метод.
С помощью этого метода возможна количественная оценка агрегатного состояния крови — размеров и плотности агрегатовэритроцитов. Метод основан на том, что интенсивность света, прошедшего через слойсуспензии эритроцитов, изменяется в соответствии с их агрегатным состоянием. Неагрегирующая суспензия эритроцитов должна рассеивать свет максимально, так какв таком объекте имеется максимальная концентрация рассеивающих центров. В процессе агрегации происходит прогрессивное уменьшение концентрации рассеивающихцентров, что приводит к уменьшению интенсивности рассеянного света.Для получения изображений эритроцитарных агрегатов, а так же сведений о молекулярной структуре мембраны в ряде работ использовалась электронная микроскопия [88] (рисунок 13).
Однако при таком способе визуализации терялась возможностьисследования функционирующих эритроцитов в естественной среде.Кинетика спонтанной агрегации изучалась в работе [89]. В эксперименте небольшое количество крови ресуспендировалось в аутологичной плазме для достижениянебольших концентраций клеток в суспензии. Капля суспензии помещалась на покровное стекло. После этого сразу же детектировалась кинетика взаимодействияэритроцитов с помощью инвертированного оптического микроскопа.
На 24 парахэритроцитов от 4 различных доноров было показано, что спонтанная агрегация клеток представляет собой трехступенчатый процесс. После соприкосновения клетки начинают сближаться вследствие деформации и уплощения краев эритроцитов, далееклетки начинают “наползать” друг на друга. Максимальная скорость скольжениядостигалась примерно в середине перекрытия эритроцитов и составляла в среднемоколо 0,35 мкм/с. Скольжение практически останавливалось при достижении почтиполного перекрытия, и затем происходило с уже намного меньшей скоростью. Однако в данной работе не контролировалось наличие начальной скорости клеток при ихвзаимодействии, которую они приобретали в результате действия силы тяжести.Обзор литературы: применение метода оптического пинцета...48Метод оптического пинцета можно рассматривать в качестве альтернативного способа изучения эритроцитов и их агрегации.
Этот метод позволяет одновременно проводить количественные измерения агрегационных и деформационных свойств эритроцитов в естественной для них среде, а также визуализировать эксперимент в режиме реального времени. Методом оптического пинцета возможно экспериментальноеисследование одиночных эритроцитов, не взаимодействующих с подложкой, зондом,микропипеткой или другими клетками. Несмотря на то, что явление агрегации эритроцитов интенсивно изучалось на протяжении последних 20 лет, попытки определения механизмов агрегации методом оптического пинцета представлены в единичныхработах [77, 90]. В работе [90] была реализована двухлучевая модификация оптического пинцета.
Использовался АИГ-Nd лазер (1064 нм), мощность, приходящаяся накаждую из ловушек, составляла около 100 мВт. Кровь четырех здоровых доноров центрифугировалась, эритроциты отделялись от плазмы, затем изготовлялась суспензияиз той же плазмы или различных полимерных растворов, но с малой концентрациейэритроцитов. Из такой суспензии готовился образец. Типичный эксперимент заключался в следующем. В каждую из ловушек захватывался эритроцит, затем ловушкисближались до соприкосновения клеток, после чего ловушки выключались, и происходило образование двойного агрегата в течение 3–5 секунд.
Далее агрегат разрывалис помощью тех же ловушек, разводя эритроциты в противоположные стороны со скоростью около 5 мкм/с. Наблюдения показали, что в плазме разрыв агрегата возможентолько путем соскальзывания одного эритроцита по другому. Разъединение агрегатав направлении, перпендикулярном к мембране, не представлялось возможным. Болеетого, в большинстве случаев полного разъединения агрегата эритроцитов не наблюдалось. Чаще всего оставались небольшие “связки” между клетками (см. рисунок14), что дает еще один аргумент в пользу “мостиковой” теории. Такое же поведениеэритроцитов при разъединении агрегата методом оптического пинцета наблюдалось вработе [77] (рисунок 11в).
Также была замечена зависимость поведения агрегата приразрыве от времени формирования эритроцита при выключенных ловушках. Разрывагрегата происходил только тогда, когда время формирования было меньше 8 секунд.В экспериментах, где эритроциты были взвешены в различных полимерных растворах, поведение агрегата при разрыве было таким же, как и в плазме, за исключением разницы в силе агрегации эритроцитов. Например, при повышении концентрацииОбзор литературы: применение метода оптического пинцета...49Рис. 13: Изображение эритроцитарного агрегата, полученное методом электронной микроскопии.1234Рис.
14: Дезагрегация эритроцитов методом оптического пинцета [90].Обзор литературы: применение метода оптического пинцета...50фибриногена усиливалось взаимодействие эритроцитов, и скорость разведения оптических ловушек для разъединения агрегата необходимо было уменьшать.Авторы [90] считают, что данные наблюдения подтверждают гипотезу о том, чтово время агрегации эритроцитов происходит формирование мостиков. Однако они неопровергают гипотезу об агрегации за счет “истощенной зоны”, предполагая, что процесс агрегации может быть двухступенчатым. Сначала механизм “истощенной зоны”способствует сближению клеток на расстояние, на котором возможно образованиеперекрестных мостиков, в результате чего происходит агрегация.В работе [77] была продемонстрирована возможность измерения максимальнойсилы агрегации для пары эритроцитов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
