Диссертация (1105090), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Важно отметить, что обакоэффициента оценивают изменения нефотохимического тушения относительносостояния темновой адаптации образца, поэтому недостаточное время темновойадаптации может привести к заниженным значениям этих параметров [26].Использование методов импульсной флуориметрии открывает широкиевозможностидляисследованийфотосинтетическогоаппарата,однакоинтерпретация результатов представляет собой трудную задачу, так как35полученные данные могут содержать различные артефакты. Поэтому очень важнааккуратнаяпостановкаэкспериментаиверныйпараметров для оценки полученных результатов.36выборфлуоресцентныхГЛАВА 2. МЕТОДИКА И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ2.1.Объекты исследований.Основная часть работы была проведена на проростках бобов Vicia faba L.(сорт «Русские черные»).
Растения выращивали в пакетах объемом 0,5 л приестественном освещении, в ряде случаев использовалось дополнительноеосвещение лампой ESB143-65W, расположенной на высоте 30 см от ростков. Вэкспериментахбылииспользованылистьявторогояруса2-3-недельныхпроростков.В опытах с проростками бобов, обработанных фторидом натрия, вцентральную жилку, не отрывая лист от стебля, медицинским шприцом вводилираствор NaF концентрации 2∙10−2 М, в качестве контроля использовали растворNaCl той же концентрации. Затем лист оставляли на 3 часа в затенении дляестественного выведения излишка влаги.При измерении флуоресцентных характеристик в процессе осеннейдеградациихлорофиллаиспользовалилистьядубаQuercus rubra L.,произрастающего на территории Московского государственного университетаимени М.В.Ломоносова. Листья находились на разной стадии деградациихлорофилла и имели окраску от ярко-зеленой до полностью желтой (рис.
10).Измерения проводили в сентябре-октябре 2014-2015 гг.Рис. 10. Образцы листьев дуба Quercus rubra L.Листья дуба разрезали на две части, из которых одну использовали длярегистрации спектра флуоресценции, а другую – для измерения кинетикифлуоресценции с помощью PAM-флуориметра.37В опытах с листьями традесканции использовали растения вида Tradescantiafluminensis L., выращенные при двух разных интенсивностях света: 50-125 мкЭм с (низкой) и 875-1000 мкЭ м с (высокой). В работе использовали листья 4-6−2−1−2−1ярусов, считая от верхушки.Для изучения влияния физиологически активных веществ (регуляторовроста) на сельскохозяйственные культуры были использованы растения тритикалеи льна-долгунца.В опытах с тритикале (сорт «Валентин») использовали образцы с полевогоопыта, проводившегося проф.
Л.Э. Гунар и доц. А.Г. Мякиньковым в РГАУ –МСХА им. К.А. Тимирязева. Условия обработки и выращивания подробноописаны в работе [59]. Непосредственно перед посевом (август 2012 г.) семенаобрабатывали препаратами «Эпин-Экстра» и «Циркон» (фирма Нэст-М ) согласнорекомендациям фирмы-производителя. Нормы расхода препаратов в расчете на 1т семян составляли: для эпина-экстра – 200 мл, для циркона – 2 мл. Для получениярабочего состава указанные количества препаратов разводили в 10 л воды.Флуоресцентные и физиологические показатели растений тритикале определяли вначале июня 2013 г.В опыте с льном-долгунцом Linum usitatissimum L. использовали образцы сполевого опыта, проводившегося доц.
И.И. Дмитревской в РГАУ – МСХА им.К.А. Тимирязева в 2014-2015 гг. Условия обработки и выращивания подробноописаны в работе [60]. В работе использовали сорт «Восход», выведенныйПсковским научно-исследовательским институтом сельского хозяйства. Сортрекомендован для выращивания в Волго-Вятском районе, в настоящее время егоиспользуют как стандарт.2.2.Измерение спектров флуоресценции листьев растений.Спектры флуоресценции листьев растений измеряли на спектрофлуориметреSolar CM2203, оптическая схема которого представлена на рис. 11.
Лист отделялиот стебля, помещали в держатель, освещали светом с длиной волны λ = 450 нм38интенсивностью около 150 Вт/м2 в течение 70 с для стандартизации условийэксперимента, затем выдерживали в темноте в течение 5 мин (этого времени былодостаточно для наблюдения существенного индукционного эффекта), после чеговключали свет с той же длиной волны и регистрировали серию спектров вдиапазоне 630-800 нм в течение 15 мин (в случае выращивания бобов припониженной освещенности) или 20 мин (во всех остальных экспериментах).Для количественной оценки формы спектра использовали параметрω = F740/F685, где F685 и F740 – интенсивности флуоресценции на длинах волн 685 и740 нм соответственно.2.3.ИзмерениеиндукционныхизмененийфлуоресценцииХламетодом импульсной флуориметрии.Измерения индукционных изменений флуоресценции проводили припомощи импульсного флуориметра PAM-2500 (Walz, Германия).
На рис. 12представлена характерная кривая, полученная при использовании стандартногопротокола измерений.Лист помещали в темную камеру в держатель-клипсу и адаптировали ктемноте в течение 15 мин в случае традесканции или в течение 5 мин во всехостальных случаях. Затем в условиях темноты включали слабый измерительныйсвет (λ = 630 нм, ФАР ≈ 10 мкЭ м с ) и далее для определения параметра Fv/Fm−2−1подавали насыщающую вспышку. После короткого периода релаксации (30 с)включали синий действующий свет (λ = 455 нм, ФАР ≈ 150 мкЭ м с ), и на его−2−1фоне подавали кратковременные насыщающие вспышки света (Δt = 0,5 c, λ = 630нм, ФАР ≈ 3500 мкЭ м с ).−2−139Рис.
11. Оптическая схема спектрофлуориметра Solar CM2203: 1 – лампа,2 – зеркало, 3 – коллиматорный объектив, 4 – щель, 5 – решетка, 6 –плоскопараллельная пластинка, 7 – держатель с образцом, 8 – тороидальноезеркало, 9 – фотодиод.В экспериментах с традесканцией, помимо синего, использовали такжекрасный действующий свет (λ = 630 нм), ФАР, в зависимости от условийэксперимента, составляла 40, 150 или 500 мкЭ м−2с−1, насыщающие вспышкиимели следующие параметры: Δt = 0,8 с, ФАР ≈ 5000 мкЭ м−2с−1. Используязначенияинтенсивностифлуоресценции,полученныепривоздействииизмерительного и действующего света, а также насыщающих вспышек, спомощью программного обеспечения прибора автоматически вычислялись такиефлуоресцентные параметры, как Fv/Fm, ΦPSII и NPQ.
Для наблюдения темновойрелаксации действующий свет выключали, продолжая периодически подаватьнасыщающие вспышки.40Рис. 12. Характерная кривая флуоресценции листьев растений, измеренная спомощью импульсного флуориметра PAM-2500: ИС – измерительный свет, ДС –действующий свет, зигзагообразные стрелки – насыщающие вспышки.2.4.
Определение содержания хлорофилла в листьях растений.Общее содержание хлорофиллов a и b определяли спектрофотометрическимметодом. Для этого навеску листьев 120 мг растирали в фарфоровой ступке,добавляя 100% ацетон. Полученную вытяжку фильтровали через стеклянныйфильтр №2 с помощью водоструйного насоса. Затем измеряли спектрыпоглощения полученного раствора при помощи спектрофотометра UNICO 2800.Значения оптической плотности на длинах волн 645 и 662 нм использовали длявычисления концентрации хлорофиллов по следующим формулам:Ca(мг/мл) = 11,24·A662 – 2,04·A645 ;Cb(мг/мл) = 20,13·A645 – 4,19·A662 ,где Ca – концентрация хлорофилла а, Cb – концентрация хлорофилла b, A645 и A662– оптическая плотность на длинах волн 645 и 662 нм соответственно [61].41ГЛАВА 3.
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛИСТЬЕВРАСТЕНИЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛА.3.1.Спектры и индукция флуоресценции Хл а в листьях бобов,выращенных при пониженной освещенности.В этих опытах растения бобов разделяли на 6 вариантов и помещали вразличные части лаборатории, где средняя освещенность составляла 5÷10,20÷30, 30÷40, 150÷200, 500÷600 и 3000 лк. Освещенность измеряли в дневноевремя суток при помощи портативного цифрового люксметра MastechMS6610.В эксперименте использовали методику последовательной регистрацииспектров флуоресценции для получения более детальной информации охарактере изменения формы спектра в процессе медленной индукциифлуоресценции.Такжебылииспользованыметодыимпульснойфлуориметрии и методика одновременной регистрации индукционныхизменений флуоресценции на длинах волн 685 и 740 нм (соответствуютмаксимумам в спектре флуоресценции листа), позволяющая изучитьизменениеотношенияω = F740/F685привключениивозбуждающегофлуоресценцию света.Полученные закономерности хорошо воспроизводились в четырехсериях экспериментов, проведенных на растениях разных посадок в ноябре идекабре 2012 г.
и феврале и мае 2016 г.Использованиеразличныхсветовыхрежимовпривыращиванииоказывало значительное воздействие на внешний вид проростков. Приотносительно низкой освещенности (5÷200 лк) растения имели удлиненныестебли и тонкие вытянутые листья с бледно-зеленой окраской. Приотносительно высоких интенсивностях света (200 лк и более) растения имелихорошо развитые листья, сбалансированный рост, насыщенную зеленую42окраску.
Содержание хлорофилла в листьях варьировалось от 0,3 мг на 1 гсырой массы для освещенности 5÷10 лк до 1,6 мг/г для 3000 лк.Характерные спектры флуоресценции листьев бобов, выращенных приразной освещенности, представлены на рис. 13. Временны̀е интервалы междумоментом включения освещения и регистрацией F685 и F740 различаются. Этоприводит к искажению истинного значения отношения F740/F685 в случаеспектров, полученных сразу после 5 мин темновой адаптации (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
