Автореферат (1102504), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Параметры потенциалов Сn (гдеn = 1, 2, ..., 6) для углов -CA_-C_N1_CA1 и -C_N1_CA1_C1 вошли в окончательный варианттопологии хромофора белка DsRed.Пользуясь стандартной схемой проведения МД расчета с использованием силового поляOPLS-AA/DsRed, был проведен МД расчет для системы, содержащей тетрамер белка DsRed,12 510 молекул воды и четыре иона натрия на протяжении 4.2 нс и получена усредненная потраектории структура хромофора, обозначенная QYGMD,Average.Сравнение геометрии хромофора QYGMD,Average со структурами, полученными РСА (PDB ID1ZGO, 1G7K, 1GGX) показало, что с точностью до теплового движения все структуры идентичны,что подтверждает правильность параметризации хромофора.Создание топологии хромофоров мутантов mRFP1Поскольку на момент проведения работы отсутствовали данные о расшифровке структурmRFP1 и мутантных белков методами РСА или ЯМР, для проведения молекулярно-динамическихрасчетов в качестве начальных использовались структуры, построенные на основе структурыближайшего гомолога, белка DsRed, путем внесения соответствующих аминокислотных замен спомощью программы SwissPDBViewer.
Полученные структуры были оптимизированы методомминимизации энергии по алгоритму L-BFGS в программном пакете GROMACS.МД-расчеты проводились на основе силового поля OPLS-AA/DsRed. Для создания описанийхромофоровмутантныхмодифицированномубелковучасткутребовалосьхромофора.внестиПараметрыизменения,былисоответствующиеизвлеченыиззаписейсоответствующих аминокислот.Анализ полученных в результате молекулярно-динамических расчетов траекторий такжеосуществлялся средствами программного пакета GROMACS.Создание генов и наработка целевого продукта мутантов белка mRFP1В работе использовался ген красного мономерного флуоресцентного белка mRFP1 изплазмидного вектора pMT-mRFP1, любезно предоставленного «Fungal Genetics Stock Center»,Университет Миссури, США.Основу олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза составил метод«ник-трансляции», при котором участок векторной ДНК тем или иным способом получают воднотяжевой форме, связывают его с синтетическим олигонуклеотидом, спланированным так, что14он комплементарен выбранному участку ДНК за исключением небольшого фрагмента в областивнесения мутации.
Полученный комплекс достраивают ДНК-полимеразой и замыкают ДНКлигазой в двутяжевую ковалентно-замкнутую кольцевую векторную ДНК с небольшимнекомплементарным участком в районе планируемой мутации. После трансформации подходящихкомпетентных клеток и клонирования проводят поиск и идентификацию целевых мутантов.Для проведения генно-инженерных модификаций была осуществлена оригинальнаяреализация метода «ник-трансляции» (рис. 5), для проведения которой недалеко от места введениямутации должен существовать уникальный сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции.сайт рестрикцииместомутагенезарестриктаза SnaBIPPIIIPотжигпраймеровOHPPIVэкзонуклеаза IIIPPIIIТ4 ДНК-лигазаOHOHP1. фрагмент Кленова2. T4 ДНК-лигазаДНК-полимераза IVVIРис. 5. Схема проведения сайт-специфического мутагенеза с использованием «ник-трансляции».Исходная двутяжевая кольцевая плазмидная ДНК была расщеплена в уникальном сайтеэндонуклеазой рестрикции с образованием линеаризованной двутяжевой плазмидной ДНК скороткими однотяжевыми участками на концах («липкими концами») (стадия I на рис.
5).Затем плазмидная ДНК была обработана экзонуклеазой III, которая с обоих концовлинеаризованного вектора высвобождает достаточно протяженные однотяжевые участки (стадияII на рис. 5).Наосвобожденныеучасткикомплементарнобылиотожженысинтетическиеолигонуклеотиды: мутаген и адаптер (стадия III на рис. 5). Олигонуклеотид-мутаген имелфосфатную группу на 5’-конце, в то время как синтетический олигонуклеотид-адаптер не имелтакой группы.
Структура 3’-концевых участков олигонуклеотидов была подобрана таким образом,15чтобыпослегибридизациииобработкиконструкцииДНК-лигазойконцывекторакомплементарно соединились с восстановлением исходного базового сайта эндонуклеазырестрикции (стадия IV на рис. 5).На следующем этапе полученный гибрид был достроен фрагментом Кленова ДНКполимеразы I E.coli в присутствии смеси дезоксирибонуклиозидтрифосфатов и ДНК-лигазы(стадия V на рис. 5). Основной продукт этой реакции – кольцевой гетеродуплекс ДНК с разрывомв одном из тяжей (в области гибридизации с дефосфорилированным адаптером) и нарушениемдвойной спирали вследствие некомплементарности в области мутагенеза, причем целевая«мутантная» форма гена встроена в ковалентно-замкнутый тяж ДНК, не имеющий разрыва, аисходная структура гена «дикого типа» встроена в тяж с искусственным разрывом,расположенным в направлении 3’ → 5’ на относительно небольшом расстоянии от местамутагенеза.Обработка полученной гетеродуплексной конструкции ДНК-полимеразой I E.coli привела креакции так называемой «ник-трансляции» (стадия VI на рис.
5). В ходе этой реакции ферментосуществляет деградацию цепи с разрывом с 3’-конца и одновременную достройку с 5’-конца наоснове комплементарной цепи. В качестве «затравки» используется нефосфорилированныйолигонуклеотид-адаптер.Послепрохожденияполимеразойрайонанекомплементарностиобразуется ДНК, обе цепи которой в районе мутагенеза будут иметь запланированную структуру.Полученной кольцевой ковалентно-замкнутой молекулой ДНК трансформировали клеткиE.coli.
Выделенная из полученной культуры клеток плазмидная ДНК была подвергнутарестриктному анализу, структура гена была проверена методом прямого секвенирования. Отборклонов проводился с использованием анализа методом ПЦР, рестриктного анализа исеквенирования участка, содержащего предполагаемые мутации. Плазмидными ДНК отобранныхклонов трансформировали компетентные клетки E.coli, которые инокулировали в питательнуюсреду DYT. Из выросшей биомассы клеток-суперпродуцентов (ночной культуры) после лизисаметодом никель-афинной хроматографии были выделены экспрессируемые белки. Пробы белковбыли подвергнуты диализу для очистки.
Концентрации полученных препаратов белков составилиот 0.3 до 1.5 мг/мл.Оптические свойства полученных мутантных белковДля всех полученных препаратов белков были измерены спектры поглощения, возбужденияи испускания флуоресценции.Двенадцать из полученных 20 белков (60%) обладают окраской и флуоресценцией (табл. 1).Одиннадцать из них флуоресцируют в красной области, мутант с заменой на глицин обладает16только зеленой флуоресценцией, что может свидетельствовать о том, что полного созревания непрошло, а хромофор остался в промежуточной стадии, аналогичной белкам семейства GFP.№Кодовое имя ЗаменаНазваниеМаксимумМаксимумаминокислотывозбуждения,эмиссии, нмψε, M-1см-1нм1mRFP1-17D+нетглутамин5846070.2741 8002A5Nаспарагин5706040.176 90034iAаланин5786050.192 40047DLлейцин5776130.123 600511snCцистеин5685880.2135 650622ssSсерин5615790.2132 7007A8Hгистидин5886180.1312 700816DGглицин5045150.02516 200914DEглутамат577 – 5886100.349 0001013mnMметионинне окрашенне флуоресцирует1112mnKлизинне окрашенне флуоресцирует125IIизолейцинне окрашенне флуоресцирует1311inTтреонин560 – 5705890.02425 000145FFфенилаланин5956240.0324 3501510V,8DVвалинне окрашенне флуоресцирует1639RRаргининне окрашенне флуоресцирует1713PPпролинне окрашенне флуоресцирует1819YYтирозин1911DDаспартатне окрашенне флуоресцирует2031WWтриптофанне окрашенне флуоресцирует5956240.042 430Таблица 1.
Оптические характеристики mRFP и мутантных белков с заменами в 66 положенииаминокислотной последовательности. Приведены кодовые имена мутантов и соответствующиеим замены, ψ – квантовый выход флуоресценции, ε – эффективный коэффициент экстинкции.Анализ спектров поглощения и возбужденияУ белка mRFP1 и его мутантов с аминокислотными заменами Q66A, Q66L, Q66S, Q66H,Q66C, Q66N в спектрах поглощения присутствуют две полосы поглощения: зеленая и красная17(табл. 2).
Для всех белков, кроме белка Q66N, значения длин волн, соответствующих максимумамзеленой полосы, лежат в диапазоне 500-509 нм, в то время как для белка Q66N максимумпоглощения зеленой полосы находится при 525 нм. Эту полосу можно отнести к поглощению неполностью созревшей зеленой формы хромофора.
Значения длин волн, соответствующихмаксимумам красной полосы, лежат в диапазоне 561-598 нм и различны для различных замен в 66положении.Зеленая формаБелокКрасная формаМаксимумε,Максимумε,МаксимумМаксимумпоглощения,M-1см-1поглощения,M-1см-1возбуждения,эмиссии,нмнмнмнмψmRFP150334 60058441 8005846070.27Q66N52513 7005706 9005706040.17Q66H50435 60058812 7005886180.13Q66L50064 0005823 6005776130.12Q66C50536 40056835 6505685880.21Q66A50029 6005822 4005786050.19Q66S50624 90056232 7005615790.21Q66F50826 6005938 0005936170.03Q66T509плечо56125 000560 – 5705890.024Q66Y5081 2005922 4005956240.04Q66E50357 0005889000577 – 5886100.34Таблица 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
