Автореферат (1102504), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Описывается применение метода МД для нахождения равновесных структурфлуоресцентных белков в растворе, приведены все параметры для запуска МД-симуляций ианализа полученных траекторий. Использовались программный пакет GROMACS и силовое полеOPLS-AA в виде его модификации OPLS-AA/DsRed, содержащей параметры топологийвсевозможных хромофоров красного типа как отдельных уникальных аминокислотных остатков.Указаны все стадии, уравнения и параметры расчета.В третьей главе описывается создание топологий всех вариантов хромофоров дляпроведения молекулярно-динамических симуляций. Описаны методы и параметры квантовомеханических (КМ) расчетов энергии модельной молекулы, отвечающей основной частихромофора, содержащейπ-электроны ароматических колец.
Описано получение зарядов,равновесных длин связей и значений валентных и двугранных углов модельной молекулы.7Описано получениепрофилейэнергиивалентного идвухдвугранныхугловвокругспецифического участка -C_N1_CA1, не похожего ни на одну из описанных в поле OPLS-AAмолекул и/или частей молекул. Приведены полные таблицы параметров силового поля дляописания хромофора для проведения МД-симуляций. Приведено сравнение структур белка DsRed,полученных в результате МД-симуляций и данных рентгено-структурного анализа.
Показано, чтоструктуры совпадают с точностью до теплового движения молекул, т.е. топология хромофораверна. Проведен анализ изменения геометрии для всех вариантов мутаций хромофора по первойпозиции, проведен поиск корреляций изменений геометрических параметров и оптическихсвойств.В четвертой главе диссертации описана процедура создания методами генной инженериидвадцати плазмид на основе гена белка mRFP1, содержащих гены всех возможных вариантовфлуоресцентных белков с заменами по 66 позиции.
Описаны методы наработки и очисткицелевого продукта белков.В пятой главе описаны методы оптических исследований флуоресцентных белков.Проведен анализ спектров поглощения, возбуждения и эмиссии флуоресценции. Описаноопределение оптических характеристик методом нелинейной флуориметрии. Показано что, толькос применением методов нелинейной флуориметрии возможно разделить вклады различных формхромофоров в спектры поглощения и определить истинные фотофизические параметрыпоглощающих молекул.
Вычислены концентрации различных форм белков в растворе. Найденыкорреляциимеждуоптическимисвойствамибелковигеометрическимиаминокислотного остатка по 66 положению (в первой позиции хромофора).8параметрамиОсновные результаты работыРасчет параметров топологи хромофоровХромофор белка DsRed рассматривается как уникальный аминокислотный остаток в составеполипептидной цепи. Хромофор обладает сильной делокализацией электронной плотности, чтозначительно отличает его от любого соединения, ранее описанного в силовом поле OPLS-AA. Этообусловило необходимость получения оригинальных параметров для описания хромофора.Для проведения ab initio КМ-расчетов использовался программный пакет GAMESS.Процедура геометрической оптимизации структуры молекулы проводиласьab initio сиспользованием ограниченного метода Хартри-Фока RHF, базисом волновых функций 6-31G**.Расчет проводился с применением теории функционала плотности DFT с использованиемтрехпараметрического функционала Бека B3LYP.Для нахождения значений эффективных зарядов атомов, образующих хромофор, былаиспользована программа R.E.D.
Эта программа позволяет находить такие эффективные значенияточечных зарядов атомов молекулы в рамках МД-представлений, что электростатическое поле,порождаемое такими зарядами, аппроксимирует электростатическое поле молекулы, рассчитанноеквантово-механически.Строение нейтральной формы хромофора и его связь с белком DsRed показаны на рисунке 1.Каждому атому, входящему в состав хромофора, было присвоено уникальное имя. Имена атомовсостоят из символа элемента, а также буквенно-цифрового индекса положения атома в молекуле.В качестве первого приближения использовалась топология хромофора белка DsRed,порождаемая типами атомов, входящих в хромофор.
Типы атомов подбирали по аналогии ссоединениями, описанными в поле OPLS-AA.9Рис. 1. Строение нейтральной формы хромофора DsRed в составе белковой цепи. Хромофорочерчен пунктиром, Nter – N-концевой фрагмент белковой цепи, Cter – С-концевой фрагментбелковой цепи. Указаны имена атомов для создания топологии.Для атомов CZ, OH и HH хромофора (рис. 1) в качестве аналогов для задания типа быливыбраны атом углерода C при гидроксильном радикале фенола, а также атомы кислорода иводорода гидроксильного радикала фенола из имеющегося в поле OPLS-AA описания молекулыфенола.
Для атомов CE1, CE2, CD1, CD2, CG2, HE1, HE2, HD1, HD2 и атома CB2 хромофора вкачестве аналогов были выбраны атомы углерода и водорода из описания молекулы бензола вполе OPLS-AA. Для атомов CA2 и C1, N2, N3 хромофора в качестве аналогов были выбраны,соответственно, атомы C4, N7, N9 из описания аденина в поле OPLS-AA. Атому N1 был приписантип атома N3 из описания в силовом поле OPLS-AA цитозина.
Атомам C2 и O2 были приписанытипы атомов C6 и связанного с ним кислорода O, соответственно, из описания гуанина.Для атомов хромофора, входящих в состав бокового радикала, соответствующего боковомурадикалу аминокислотного остатка Gln66 незрелого белка DsRed в качестве аналогов быливыбраны соответствующие атомы из описания глутамина в силовом поле OPLS-AA. Для атомаCA3 хромофора белка DsRed в качестве аналога был выбран Cα-атом из описания глицина в полеOPLS-AA.Данный набор параметров является первым приближением топологии нейтральной формыхромофора белка DsRed.В конечный вариант топологии хромофора белка DsRed из данного начального наборавошли параметры атомов для расчета потенциала Леннарда-Джонса и жесткости связей,10валентных и двугранных углов (за исключением углов -C_N1_CA1, -CA_–C_N1_CA1 иC_N1_CA1_C1, жесткости которых были рассчитаны отдельно).Для уточнения набора параметров, описывающих хромофор, необходимо квантовомеханически рассчитать эффективные заряды атомов, равновесные значения длин связей,валентных и двугранных углов.
Для этого была сконструирована модельная молекула A, схожаяпо строению с хромофором (рис. 2).Рис. 2. Модельная молекула A.Параметры атомов и межатомных взаимодействий бокового радикала хромофора,соответствующего боковому радикалу аминокислотного остатка Gln66 незрелого белка DsRedзадавались равными параметрам глутамина из силового поля OPLS-AA.
Поэтому, для упрощениярасчетов, в модельную молекулу А не были включены атомы: CG1, HG11, HG12, CD3, OE1, NE1,HE11, HE12 (рис. 1), а к атому CB1 для насыщения валентности был добавлен атом водородаHB13 (рис. 2).Дополнительно для расчета параметров валентного и двугранных углов при атоме N1 вмодельную молекулу А был включен фрагмент предшествующего хромофору остаткафенилаланина Phe65 (нумерация по аминокислотной последовательности белка DsRed),включающий атомы: -C, -O, -CA и -HA.
К атому -CA были добавлены атомы водорода -HA1 и HA2 (рис. 2) для насыщения свободных валентностей.Для определения значений эффективных зарядов атомов, равновесных значений длин связей,валентныхидвугранныхугловквантово-механическибылапроведенагеометрическаяоптимизация структуры модельной молекулы A. В качестве исходной структуры модельной11молекулы A была использована структура хромофора в структуре белка DsRed (PDB ID 1GGX).Данная структура модельной молекулы A была названа A1GGX. В результате расчета былаполучена равновесная структура модельной молекулы А, названная Aeq, отвечающая состояниюмолекулы A в энергетическом минимуме. Полученные значения длин связей и углов структурыAeq, были использованы в качестве значений равновесных длин связейдвугранных углов, валентных углови, в окончательном описании топологии хромофора белка DsRed в полеOPLS-AA.Для структуры Aeq квантово-механически были рассчитаны эффективные значения точечныхзарядов на атомах при помощи программы R.E.D.
Полученные значения зарядов использовались вкачестве уточненных зарядов атомов хромофора и были внесены в окончательный варианттопологии хромофора белка DsRed в поле OPLS-AA.Для расчета параметров валентного угла -C_N1_CA1 была использована структура Aeq. Вней изменяли равновесное значение валентного угла -C_N1_CA1 (0= 123.8°) на величину -5° до+5° с шагом в 1°, оставляя значения всех остальных углов и связей неизменными. Тем самым, былполучен набор из десяти неравновесных структур, обозначенных B* (Δ ).Длякаждойтакойструктурыквантово-механическибылапроведенапроцедурагеометрической оптимизации с фиксированным значением валентного угла . В результате былполучен набор из десяти новых равновесных структур, с фиксированным значением валентногоугла , обозначенных как Beq (Δ ).Все структуры вместе со структурой Aeq имеют заданное отклонение Δ валентного углаотего равновесного значения в пределах -5° до +5°, включая 0° (равновесное значение для структурыAeq) и геометрически оптимизированную структуру всех остальных частей молекулы.
Дляполученных структур была вычислена энергия (рис. 3).Для нахождения параметров потенциалов двугранных углов -CA_-C_N1_CA1 и C_N1_CA1_C1 в качестве исходной структуры модельной молекулы A была использованаравновесная структура Aeq, в которой изменяли значение соответствующего угла, в результатечего был получен набор неравновесных структур, в которых углы принимал значения от 0° до360° с шагом 20°, проведена процедура геометрической КМ-оптимизации с фиксированнымзначением соответствующего двугранного угла и вычислена энергия (рис.
4).122,5V(), кДж/моль2,01,51,00,50,0-6-4-20246, градусыРис. 3. Зависимость энергии от значения валентного угла -C_N1_CA1. Квадратами показанызначения энергии, полученной в результате квантово-механического расчета, сплошная линия –аппроксимация гармоническим потенциалом.6050V, кДж/моль403020100050100150200250300350угол, градусыРис. 4. Зависимость энергии от значений валентный углов -CA_-C_N1_CA1 и C_N1_CA1_C1.Квадратами и кругами показаны значения энергии по результатам квантово-механическогорасчета для структур с фиксацией углов -CA_-C_N1_CA1 и C_N1_CA1_C1, соответственно,сплошная линия – аппроксимация расчетных данных периодическим гармоническим потенциалом.13Полученныенаборыточекбылиаппроксимированыкривыми,описывающимипериодический потенциал изменения величины двугранного угла.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
