Автореферат (1102504), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Оптические свойства зеленых и красных форм хромофоров белка mRFP1 имутантных белков. ε – эффективный коэффициент экстинкции в максимуме поглощения, ψ –квантовый выход флуоресценции.Определены эффективные коэффициенты экстинкции и квантовые выходы флуоресценциипри длинах волн, соответствующих максимумам зеленых и красных полос (табл. 2).Положение максимумов поглощения зеленой полосы мутантов практически не зависит отзаменяемого остатка, напротив, положения максимумов поглощения красной полосы мутантов, атакже максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции зависит от заменяемого остатка.Экспериментальные данные не противоречат представлениям, согласно которым вполученных препаратах имеется две формы созревших флуоресцентных белков – красная изеленая.Если предположить, что зеленая форма хромофора отличается от красной отсутствием18двойной связи между Cα и N атомами 66 аминокислотного остатка, то собственно системасопряженных π-связей зеленой формы хромофора не будет в себя включать 66 аминокислотныйостаток и можно предположить, что его замена не должна значительно влиять на спектральныесвойства.

В случае же «красного» хромофора мутантов дегидрирование связи между Cα и Nатомами вовлекает углеродный скелет 66 аминокислотного остатка в систему сопряжения иизменения в боковом радикале этого остатка могут приводить к «тонкой» настройке спектровпоглощения и флуоресценции.Выявлены корреляции между спектральными свойствами полученных белков (длинами волнмаксимумоввозбужденияиэмиссиифлуоресценции) игеометрическимипараметрамимутируемых аминокислотных остатков (площадь и объем). С увеличением размеров остаткасдвигаются в более красную область положения максимумов возбуждения и эмиссиифлуоресценции (рис. 6).Для набора мутантов Q66A, Q66L, Q66S, Q66H, Q66C, Q66N, Q66T, Q66Y, Q66F, Q66Eположения максимумов возбуждения флуоресценции коррелируют с объемом остатка по 66положению с коэффициентом корреляции 0.66, положения максимумов эмиссии коррелируют собъемом со значением 0.63.

Однако если из набора мутантов исключить неполярныеаминокислотные остатки (аланин, лейцин, тирозин и фенилаланин), то в оставшемся рядуполярных аминокислотных остатков степени корреляций возрастают до 0.92 и 0.83,соответственно Примечательно, что в ряду неполярных замен коэффициенты корреляции низки –0.28 и 0.69, соответственно. Данное расщепление можно объяснить наличием двух факторов,оказывающих влияние на спектральные свойства:1.геометрический размер заменяемой аминокислоты (приводящий к отдалению отхромофора части аминокислот окружения с увеличением размера остатка)2.в зависимости от типа аминокислоты по 66 положению возможно образованиеводородных связей полярными аминокислотами с остатком Glu215, а так же изменениеэнергии системы в случае замены на алифатические аминокислотные остатки за счетгидрофобных взаимодействий.Интересно, что для мутантов зеленого флуоресцентного белка GFP наблюдается такая жекартина (рис.

7). Исходный GFP дикого типа содержит серин, также были получены мутанты,содержащие вместо серина аланин, цистеин и лейцин, и опять прослеживается корреляция объемас максимумами возбуждения и эмиссии.19His620Glu610GlnAsnдлина волны, нм600590CysThrGlu580GlnHisSerCys570AsnThrSer5608090100110120130о140150160объем, А3Рис. 6. Зависимости положений максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции от объемовбоковых радикалов аминокислотных остатков, находящихся в первом положении хромофора длябелка mRFP1 и его мутантов с заменами в 66 положении. Квадратами обозначены значениямаксимума возбуждения, кругами – максимума эмиссии.510LeuCysSer505Alaдлина волны, нм500495490485Leu480CysSer475Ala47080100120140o1601803объем, АРис.

7. Зависимость положений максимумов возбуждения (квадраты) и эмиссии (круги)флуоресценции от объемов боковых радикалов аминокислотных остатков для белка GFP и егомутантов с заменами в 65 положении.20Анализ МД-структур мутантных белков и mRFP1Структуры, полученные в результате молекулярно-динамических расчетов, сохранилиобщую форму, характерную для флуоресцентных белков (β-бочонок, внутри которого проходит αспираль с хромофором в ее центральной части). Хромофоры остались плоскими и при наложениихорошо совмещаются (см.

рис. 8).Рис. 8. Сравнение 5 Å окружения хромофоров белков mRFP1, Q66N, Q66C Q66A и Q66S.Анализ полученных в результате молекулярно-динамических симуляций средних потраектории структур белков показывает, что полярные боковые радикалы аминокислот в 66положении могут образовывать водородные связи с глутамином 215. Образование выгодной поэнергии водородной связи требует сближения соответствующих атомов.

Однако такое сближениене может происходить за счет изменения положения Glu215, т.к. он является частью жесткого βбочонка, а нарушение конфигурации бочонка требует больших энергетических затрат. Хромофорявляется гораздо более подвижной структурой, поэтому осуществить образование необходимойводородной связи за счет изменения конформации хромофора энергетически выгоднее.

Какпоказали результаты молекулярно-динамических расчетов, у разных мутантных белков21действительно наблюдается существенное изменение значений торсионных углов в хромофоре.Энергетические изменения в результате образования новой водородной связи приводят кизменению геометрии бокового остатка и подвижности хромофора в целом и, как следствие,спектральных свойств соответствующих белков.Определение оптических характеристик методом нелинейной флуориметрииНелинейная лазерная флуориметрия позволяет определять все три молекулярныхфотофизических параметра – сечение поглощения хромофора , время жизни флуоресценции 3 иконстанту синглет-триплетной конверсии K32.

Однако для практической реализации этойвозможности необходим специальный подбор параметров импульса лазерного излучения,возбуждающего флуоресценцию, при которых обеспечивается достаточно высокая практическаяустойчивость решения обратной задачи. В данной работе задача была редуцированна додвухпараметрической, в которой для каждого из белков определяемыми параметрами были  иK32, а их полные времена жизни флуоресценции 3 были определены независимо напикосекундном лазерном флуорометре. Измеренные кривые затухания флуоресценции всех трехпрепаратов оказались одноэкспоненциальными, восстановленные времена 3 (время жизнифлуоресценции) приведены в таблице 3.Определение соотношения концентраций между зеленой и красной формамибелковИспользуя совместно метод нелинейной флуориметрии и классические методы, можноопределить соотношение концентраций между флуоресцирующим и нефлуоресцирующимхромопротеинами красного флуоресцентного белка в растворе, решая следующую системууравнений:22индексы 532, 570 и red, green обозначают значения длины волны возбуждающегоизлучения и формы белка, соответственно;где nred, ngreen – концентрации красной и зеленой форм белка в растворе [см-3], n0 – общаяконцентрация молекул белка,  – сечение поглощения хромофора, RS – сечение комбинационногорассеяния (КР) воды, D – оптическая плотность раствора белка, Ф0 – флуоресцентный параметр вотсутствии насыщения флуоресценции, l – толщина слоя раствора при абсорбционныхизмерениях, также предполагается, что квантовый выход η не зависит от длины волнывозбуждения.Значение длины волны возбуждения 570 нм было выбрано так, чтобы оптическая плотностьD,измереннаяспомощьюспектрофотометра,определяласьпоглощениемтолькофлуоресцирующей красной формой белка, т.е.

чтобы для всех образцов было выполнено D = Dred.Полученное значение сеченияпозволяет определить индивидуальные значениясечения поглощения  [см2] и коэффициента экстинкции  = 2.6·1020· [М-1см-1] хромофора вобласти длин волн, где измеренные величины оптической плотности D определяются толькопоглощением красной формы белка, в частности, коэффициент экстинкции в максимуме полосыпоглощения (см. таблицу 3).Метод был опробован на примере трех белков, имеющих явно выраженные красную изеленую полосы в спектрах поглощения: mRFP1, Q66S и Q66C (см.

таблицу 3).mRFP1Q66CQ66S, 10-16см23.40.630.52.20.5, 10-17см22.40.41.60.42.30.4, 10-16см26.51.15.10.830.5, мМ-1см-121540135208513nred / n00.260.060.170.060.340.06ngreen / n00.740.060.830.060.660.06nred / ngreen1:31:51:23, нс30.152.80.142.90.14T00.0200.020.050.020.240.030.190.040.200.04Таблица 3. Индивидуальные оптические характеристики белков mRFP1, Q66C и Q66S.23В максимуме полосы поглощения красной формы белка mRFP1 ( = 584 нм): сечениесоставляет (8.21.5)·10-16 [см2], что соответствует коэффициентупоглощения хромофора, равному 21540 [мМ-1см-1].

Полученное значение в 4 раза выше определенногоэкстинкцииранее другими авторами. Такое различие связанно с тем, что в этих работах при расчете использовали суммарную концентрацию белка (и поэтому определяли интегральный коэффициентэкстинкции), а не парциальную. Как следствие, определение парциальной концентрациихромофоров позволило найти индивидуальные коэффициенты экстинкции двух форм белков. Вобщем случае, определение оптических характеристик ФБ на основе интегральных характеристикпрепарата является некорректным.

Предложенный метод позволяет определять истинныехарактеристики флуоресцентных белков.Как было указано ранее, положение максимумов поглощения зеленой полосы мутантовпрактически не зависит от типа заменяемого остатка. Напротив, положения максимумовпоглощения красной полосы мутантов, а также максимумов возбуждения и эмиссиифлуоресценции зависят от заменяемого остатка и хорошо коррелируют с объемом боковогорадикала 66-ого аминокислотного остатка (рис. 6), причем с увеличением объема положениямаксимумов сдвигаются в длинноволновую область спектра. Аналогичная корреляция былавыявлена и для истинных коэффициентов экстинкции (рис.

9).220-1коэффициент экстинкции, мМ см-1Gln200180160140Cys120100Ser808090100110120o1301401503объем, АРис. 9. Зависимость истинного коэффициента экстинкции от объемов аминокислотногоостатка по 66 положению.24Результаты и выводы1.Методами квантовой химии и молекулярной динамики в силовом поле OPLS-AA созданатопология хромофора белка mRFP1 как нового аминокислотного остатка и рассчитаны еепараметры.

Проведенное молекулярно-динамическое моделирование структуры белка DsRed (саналогичным хромофором) и сравнение с имеющимися рентгено-структурными данными показалоправильность созданной топологии.2.Методами квантовой химии и молекулярной динамики в силовом поле OPLS-AA созданытопологии и рассчитаны параметры для всех 20 возможных хромофоров с заменами по 66позиции.3.Созданы PDB-файлы структур белка mRFP1 и его мутантов.4.Проведено молекулярно-динамическое моделирование пространственных структур белковв растворе. Рассчитаны равновесные структуры белков.

Характеристики

Список файлов диссертации