Автореферат (1102504)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

На правах рукописиВржещ Евгений ПетровичВлияние аминокислотных замен на спектральныесвойства флуоресцентных белков на примереmRFP103.01.02 – биофизикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМОСКВА 2012Работа выполнена на кафедре общей физики Физического факультета и Факультете биоинженериии биоинформатики Московского Государственного Университета им.

М.В. Ломоносова.Научный руководитель:доктор физико-математических наук, профессорСалецкий Александр Михайловичзаведующий кафедрой общей физики Физического факультета МГУОфициальные оппоненты:Савицкий Александр Павловичдоктор химических наук, профессорруководитель лаборатории физической биохимииИнститута биохимии им. А.Н. Баха РАНГригоренко Белла Людвиговнадоктор физико-математических наукстарший научный сотрудник Химического факультета МГУВедущая организация:Оренбургский Государственный Университет.Защита состоится 22 марта 2012 года в 14 часов 00 минут на заседании Диссертационного советаД 501.001.96 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу:119991, Россия, г. Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ, биологический факультет, кафедрабиофизики, аудитория «Новая».С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МосковскогоГосударственного Университета им.

М.В. Ломоносова.Автореферат разослан «» февраля 2012 года.Ученый секретарьДиссертационного совета Д 501.001.96Доктор биологических наукСтраховская М.Г.Общая характеристика работыАктуальность темыВ современных отраслях науки, изучающих живые организмы, актуальным являетсяполучение качественно новых методов и подходов для наблюдения различных процессов винтактных живых организмах. Одним из таких методов стало применение флуоресцентныхбелков.Флуоресцентные белки активно используются в исследовании прижизненных процессов вживых клетках, тканях и организмах, таких как активность работы промотеров, биохимическиевзаимодействия, локализации различных структур и др.

Ген флуоресцентного белка с помощьюстандартных биохимических методов вносится в генетический аппарат исследуемого объекта идальнейшая экспрессия белка и его свечение не требуют наличия дополнительных кофакторов илиспецифических реагентов (кроме атмосферного кислорода).

Набор существующих на данныймомент флуоресцентных белков достаточно разнообразен: максимум эмиссии флуоресценциибелков занимает широкую область спектра: от синей (менее 450 нм) до красной (708 нм) частейвидимогоизлучения.Такжеразличным флуоресцентнымбелкамсвойственнобольшоеразнообразие значений таких параметров, как квантовый выход флуоресценции, коэффициентэкстинкции, фотостабильность и пр.Обычно новые мутанты флуоресцентных белков получают с помощью случайного илинаправленногомутагенезапонесколькимключевымпозициямвбелкесотборомудовлетворяющих по характеристикам клонов. Такой подход дает мало информации о влияниикаждой замены на свойства белка и не позволяет наперед прогнозировать полученные свойства,так как взаимосвязь между оптическими свойствами флуоресцентных белков и их структуройпрактически не исследована.

Отсутствует методика прогнозирования флуоресцентных свойствтого или иного флуоресцентного белка на основании его структуры, т.е. общая задача разработкиалгоритма дизайна белков с заранее заданными свойствами не решена. Такая задача может бытьрешенапутеманализасвойствмутантныхбелков,содержащихединичныеточечныеаминокислотные замены, с последующим моделированием их структур in silico с помощьюметодов квантовой химии и молекулярной динамики для поиска корреляций параметров структурс оптическими свойствами.3Цели и задачи исследованияЦелью данного исследования является изучение влияния аминокислотных замен наструктуру и свойства мутантов красного флуоресцентного белка mRFP1 in silico и in vitro сиспользованием методов квантовой химии, молекулярной динамики, генной инженерии испектрально-люминесцентной спектроскопии.

Исходя из этого, были сформулированы следующиезадачи исследования:создать топологию хромофора белка mRFP1 как нового аминокислотного остатка всиловом поле и вычислить ее параметры;создать PDB-файлы для мутантов белка mRFP1, отредактировать файлы силового поляи создать топологии, соответствующие хромофорам мутантов;рассчитать равновесные трехмерные структуры мутантов белка mRFP1 и провестианализ влияния замены аминокислотного остатка глутамина по 66 положению нагеометрические параметры белка;методом генной инженерии создать плазмиды, содержащие гены 20 мутантных белковна основе белка mRFP1 со всеми вариантами аминокислотных остатков по 66положению, провести целевую наработку препаратов белка, определить оптическиесвойства полученных препаратов;провести анализ влияния замены аминокислотного остатка глутамина по 66 положениюна оптические свойства белка и сопоставить с изменением геометрических параметров;методами нелинейной лазерной флуориметрии установить истинные фотофизическиепараметры отдельных молекул белков и концентрации различных форм белка врастворе.Научная новизна результатов и практическая значимость работыРазработан и опробован метод генно-инженерного внесения любых наперед заданныхмутаций в ген красного мономерного флуоресцентного белка mRFP1 в области хромофора,позволяющий проводить направленный мутагенез белков с целью скрининга свойств взависимости от изменения аминокислотной последовательности.

С помощью метода впервыеполучено девятнадцать уникальных новых мутантов белка mRFP1 по 66 положению в видеконцентрированных препаратов белка и определены их оптические свойства.Впервыеразработанметодописанияипараметризацииобъектовтипакрасныхфлуоресцентных белков в силовом поле OPLS-AA (в частности, хромофора как отдельной4уникальной аминокислоты) для проведения молекулярно-динамических расчетов состояния игеометрии белков в растворе in silico.Впервые выявлены эмпирические зависимости оптических свойств флуоресцентных белковот геометрических параметров аминокислот, составляющих и/или окружающих хромофор, чтоможет быть применено при планировании мутагенеза, направленного на получение новыхфлуоресцентных белков с улучшенными свойствами.Разработан метод, позволяющий определять фотофизические параметры индивидуальныхформ хромофоров в составе смеси без ее разделения, что позволит более точно следить захарактеристиками как при получении новых вариантов флуоресцентных белков, так и приприменении их как маркеров процессов в живых системах.Впервые определенные данным методом фотофизические характеристики белка mRFP1 инекоторых его мутантов показали, что истинный коэффициент экстинкции отдельных формфлуоресцентных белков может значительно превышать 100 000 М-1см-1.Предложеноновоенаправлениевполучениииисследованиисвойствкрасныхфлуоресцентных белков, поскольку контроль за степенью созревания и концентрацией нужныхформ в растворе позволит увеличить яркость в несколько раз, что может привести к улучшениючувствительности многих методов исследования живых организмов.Положения, выносимые на защиту1.предложен метод генно-инженерного внесения любых наперед заданных мутаций в генкрасного мономерного флуоресцентного белка mRFP1 в области хромофора, позволяющийпроводить направленный мутагенез с целью скрининга свойств в зависимости от измененияаминокислотной последовательности;2.разработан метод описания и параметризации объектов типа красных флуоресцентныхбелков в силовом поле OPLS-AA, позволяющий проводить молекулярно-динамическиерасчеты состояния и геометрии белков в растворе in silico;3.выявлены эмпирические зависимости оптических свойств флуоресцентных белков отгеометрических параметров аминокислот, составляющих и/или окружающих хромофор, чтоможет применяться при планировании мутагенеза, направленного на получение новыхфлуоресцентных белков с улучшенными свойствами;4.разработан метод, позволяющий определять фотофизические параметры индивидуальныхформ хромофоров в составе смеси без ее разделения.5Апробация работыОсновные результаты работы были доложены на конференции «Альманах клиническоймедицины» в 2006 году, международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых«Ломоносов», студенческих конференциях Факультета Биоинженерии и Биоинформатики МГУ в2006-2007 годах.ПубликацииПо результатам работы опубликовано 9 работ, из них статей в рецензируемых журналах,включенных в список ВАК РФ - 5, тезисов докладов и материалов конференций – 4.Личный вклад автораВсе основные результаты работы получены лично диссертантом.

Вклад диссертанта в работуявляется определяющим.Структура диссертацииДиссертационная работа состоит из введения, пяти глав результатов, выводов и спискацитируемой литературы. Объем диссертации составляет 127 страниц, в том числе 35 рисунков, 21таблица и 27 формул. Список цитируемой литературы включает 94 наименования.6Содержание работыВо введении обоснована актуальность темы диссертации, ее научная новизна ипрактическая значимость, а также сформулирована цель и поставлены задачи исследования.Первая глава содержит обзор опубликованных данных по теме диссертации.

Описанаистория открытия флуоресцентных белков и основные природные источники. Приведенаклассификация белков по семействам с указаниями спектральных и структурных свойств.Описывается биологическая роль флуоресцентных белков в различных организмах. Проведенанализ данных о кристаллических структурах белков различных семейств. Описываютсямеханизмыформирования(созревания)хромофоровзеленогоGFPикрасногоDsRedфлуоресцентных белков, указывается различие в количестве стадий и промежуточных форм вмеханизмаххромофорасозревания.намеханизмАнализируетсясозревания.влияниеОписаныаминокислотногофлуоресцентныеокружениябелкисбудущегоразличнымиолигомерными состояниями, на примере белка DsRed показаны интерфейсы взаимодействияразличных мономеров при образовании тетрамера. Описан механизм мутагенеза, приводящий кобразованию красного мономерного флуоресцентного белка mRFP1 из тетрамерного DsRed.Описаны физические и оптические характеристики белков GFP, DsRed и mRFP1.

Проведен анализданных о влиянии замен (как на природные, так и на искусственные аминокислотные остатки) поразличным позициям хромофора на флуоресцентные свойства белка. В заключение обзоралитературы формулируется важность понимания взаимосвязи между первичной структуройбелков и оптическими свойствами.Во второй главе диссертации описываются методы молекулярной динамики (МД),конкретная их реализация для пакета программ GROMACS, синтаксис и параметры силового поляOPLS-AA.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации